Neuroscience
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用于下游分析的冷冻啮齿动物大脑区域集合
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Summary April 23rd, 2020
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此过程描述了离散冷冻大脑区域的收集，以便使用廉价和常用的工具获得高质量的蛋白质和RNA。
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此过程描述了离散冷冻大脑区域的收集，以便使用廉价且常用的工具获得高质量的蛋白质和RNA。由于大脑区域通过解剖保持收获冻结，目标分子被保留下来，研究人员有时间仔细解剖和储存感兴趣的区域。确定感兴趣的区域最初可能具有挑战性。
使用常见的大脑地标，因为它们出现和退去的部分，相对于所需的区域将明确识别。从安乐死的成年CD-1野生小鼠身上取出大脑后，在液氮或异丙烷中闪冻结组织60秒。用干冰预冷，储存在零下80摄氏度。
在解剖组织前24小时，将一个干净的大脑基质放在一叠解冻的冰柜包装上。将两个冰柜包之间的矩阵两侧夹到两者之间，确保在剃须刀槽底部和包装顶部之间留下大约半厘米。设置一个冷冻玻璃板进行解剖，将绝缘盒中冰块填充到距离顶部约五厘米处。
然后在上面放置一层2.5厘米的干冰。用黑色塑料布盖住它。将玻璃板放在塑料上。
和盘子边界周围的干冰。从冰柜中取出冷冻的大脑矩阵，将大脑皮层向上插入矩阵中。让组织与包装盒中的温度平衡 10 分钟。
在此期间保持盖子打开。使用冷钳调整大脑在矩阵中的位置，使鼻窦和横向鼻窦与方块的垂直凹槽一起。一旦大脑就位，将一把冰冷的剃须刀刀片放在其中心附近，然后将其压入组织约一毫米。
接下来，在大脑的每一端放置一个冰冷的刀片，然后一直向下按入矩阵。然后开始在旋转端添加冰镇刀片，一次放入一个插槽中，然后轻轻地将它们压入组织中一毫米。继续以一毫米间隔添加刀片，朝考达尔端工作。
当所有刀片都到位时，用手指、手掌或钝器向下按压顶部，然后从一侧到侧面缓慢地摇动它们，以穿过组织。一旦刀片到达插槽的底部，抓住刀片组的每一侧，然后来回摇晃，将它们从矩阵中释放出来。释放刀片组后，将它们的旋转侧放在玻璃板上，将干冰放在堆栈旁边或顶部，以进一步冷冻样品，以便于分离。
然后将具有锐利边缘的堆栈向下放置，并在拇指和手指之间移动堆栈来分离刀片。将玻璃板上的部分从旋转到骨面，通过将组织在手指之间弯曲或用第二个冰镇刀片分离，将组织从刀片中分离。有时，组织可能粘在刀片的两侧，必须注意保持到骨骼方向。
在开始解剖之前，打开艾伦老鼠大脑图集或其他参考，并找到确定感兴趣区域所需的地标。使用冰镇钳或刀片翻转截面。并确保整个部分感兴趣的区域是一致的。
用干净的手术刀或一拳切入部分，轻轻地将金属推入组织。来回摇动它， 使切割。收获感兴趣区域后，将其放入标有预冷却的 1.5 毫米管中，并将其存放在零下 80 摄氏度。
要处理组织，加入冷 RIPA 缓冲液进行蛋白质提取或含有溶剂的瓜尼铀，并立即将其与玻璃羽化或机械均质器均匀化。为了验证这种方法，从成年CD-1野生雄性小鼠中采集了前额皮层，并进行了RNA和蛋白质的特征。当使用毛细管电泳分析时，降解的RNA显示28S和18S核糖体带的强度损失，以及25至200个核苷酸之间的涂片。
虽然高质量的RNA在分子量较低的区域显示明显的核糖体带几乎没有信号。使用冷冻解剖方法获得的RNA与从新鲜收获的组织中准备的RNA进行比较。两种方法都产生高完整性和强核糖带的RNA。
为了确认此方法可用于保存解剖组织的微环境以供以后分析，从已储存数周的解剖中前额皮质中提取了RNA。所有样品产生的高质量RNA具有明显的核糖体带和RNA完整性数超过8。为了确认冷冻解剖样品的蛋白质完整性，将蛋白质收集到硝基纤维素，并针对高分子量目标KCC2和较低分子量蛋白的检测。
在所有情况下，频段都是尖锐和不同的，没有明显的分解产品。在整个过程中保持组织冻结非常重要，因为这样可以保留各部分的微环境，并保持部分形态，以便与大脑地图集图像进行比较。以这种方式收集的感兴趣区域可以在负 80 摄氏度下存储几个月，并可用于许多下游应用，包括 RT-qPCR、RNA-Seq、西印迹分析和 HPLC。
这种方法已被用于探索接触THC和其他大麻素的围产期啮齿动物的肢体系统内的分子变化，以更好地了解这些药物如何影响大脑发育。
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