Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Insamling av frysta gnagare hjärnregioner för nedströms analyser
Chapters
Summary April 23rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta förfarande beskriver insamling av diskreta frysta hjärnan regioner för att få högkvalitativt protein och RNA med hjälp av billiga och allmänt tillgängliga verktyg.
Transcript
Detta förfarande beskriver insamling av diskreta frysta hjärnan regioner för att få högkvalitativt protein och RNA med hjälp av billiga och allmänt tillgängliga verktyg. Eftersom hjärnan regioner hålls frysta från skörd genom dissekering, målmolekyler bevaras och forskaren har tid att noggrant dissekera och lagra regioner av intresse. Att identifiera intresseområden kan till en början vara en utmaning.
Med hjälp av vanliga hjärnan landmärken när de dyker upp och avta genom avsnitten i förhållande till de önskade regionerna kommer att göra identifiering klart. Efter att ha tagit bort hjärnor från avlivade vuxna CD-1 vilda typ möss, flash frysa vävnaden i 60 sekunder i antingen flytande kväve eller isopentan. Pre-chill med torris och förvara den på minus 80 grader Celsius.
24 timmar innan du dissekerar vävnaden, placera en ren hjärnmatris på en bunt tinade frysförpackningar. Och smörgås sidorna till matrisen mellan två frys förpackningar se till att lämna ungefär en halv centimeter mellan botten av rakhyveln slots och toppen av förpackningarna. Sätt upp en frusen glasplatta för dissektionen genom att fylla en isolerad låda med is upp till cirka fem centimeter från toppen.
Placera sedan ett 2,5 centimeters lager av torris ovanpå. Och täck den med svart plastfolie. Placera en glasskiva ovanpå plasten.
Och torris runt plattans gränser. Ta bort den frusna hjärnmatrisen från frysen och sätt in hjärnan, cortexsidan upp, i matrisen. Låt vävnaden ekvilo till temperaturen i lådan i 10 minuter.
Att hålla locket öppet under denna tid. Använd kalla tympor för att justera hjärnans position i matrisen så att sagittal sinus och tvärgående sinus linje upp med de vinkelräta spåren i blocket. När hjärnan är i position, placera ett kylt rakblad nära dess centrum och tryck den ungefär en millimeter i vävnaden.
Därefter placerar du ett kylt blad i varje ände av hjärnan och trycker hela vägen ner i matrisen. Börja sedan lägga till kylda blad i den rostrala änden, placera dem i slitsarna en i taget och försiktigt trycka dem en millimeter i vävnaden. Fortsätt att lägga till blad med en millimeter intervall, arbetar mot caudal slutet.
När alla blad är på plats, tryck ner på toppen med fingrar, handflata, eller ett trubbigt föremål och klippa dem långsamt från sida till sida för att flytta dem genom vävnaden. När bladen har nått botten av slitsarna, ta tag i varje sida av gruppen av blad och befria dem från matrisen genom att gunga fram och tillbaka. Efter att frigöra gruppen av blad placera dem rostrala sidan upp på glasplattan, och sätta torris bredvid eller ovanpå stapeln för att ytterligare frysa proverna för enklare separation.
Placera sedan stapeln med skarpa kanter nedåt och separera bladen genom att flytta stacken mellan tummen och fingrarna. Rada upp avsnittet på glasplattorna från rostral till caudal och separera vävnaden från bladen genom att böja dem mellan fingrarna, eller genom att separera dem med en andra kyld klinga. Ibland kan vävnad fastna på båda sidor av ett blad och försiktighet måste vidtas för att upprätthålla rostral till caudal orientering.
Innan dissekeringen påbörjas öppnar du Allen Mouse Brain Atlas eller en annan referens och hittar de landmärken som krävs för att identifiera intresseområden. Använd kylda tyfningar eller blad för att vända avsnittet. Och se till att den region av intresse är konsekvent i hela avsnittet.
Skär i avsnittet med en ren skalpell eller en punch, trycka metallen försiktigt men stadigt i vävnaden. Gunga den fram och tillbaka för att göra snittet. Efter skörd regionen av intresse, placera den i märkta pre-kylda 1,5 millimeter rör och lagra dem på minus 80 grader Celsius.
För att bearbeta vävnaden, tillsätt kall RIPA-buffert för proteinutvinning eller ett guanidinium som innehåller lösningsmedel för RNA-extraktion och omedelbart homogenisera den med en glasdyr eller mekanisk homogenisator. För att validera denna metod, den mediala prefrontal cortex samlades in från vuxna CD-1 vilda typ handjur möss och RNA och protein kännetecknades. När analyseras med kapillärelektrofores, visar degraderad RNA en förlust i intensiteten av 28S och 18S ribosomala band, samt ett utstryk mellan 25 och 200 nukleotider.
Medan högkvalitativa RNA visar distinkta ribosomala band liten eller ingen signal i den lägre molekylvikt regionen. RNA erhåller med hjälp av den frysta dissekeringsmetoden jämfördes med RNA som beretts från nyskördad vävnad. Båda metoderna producerar RNA med hög integritet nummer och starka ribosomal banding.
För att bekräfta att denna metod kan användas för att bevara mikromiljö av dissekerad vävnad för senare analys, extraherades RNA från dissekeras medial prefrontala cortex som hade lagrats under flera veckor. Alla prover producerade högklassiga RNA med distinkta ribosomala banding och RNA integritet nummer över åtta. För att bekräfta protein integritet av de frysta dissekerade proverna, proteinet samlades in, överförs till nitrocellulosa och sond med antikroppar mot den höga molekylvikt mål KCC2, och den lägre molekylvikt protein aktin.
I samtliga fall band var skarpa och distinkta med några urskiljbara uppdelning produkter. Det är viktigt att hålla vävnaderna frysta under hela processen eftersom detta bevarar mikromiljö av avsnitten och upprätthålla avsnitt morfologi för jämförelse med hjärnan atlas bilder. Regioner av intresse som samlas in på detta sätt kan lagras i flera månader vid negativ 80 grader Celsius och kan utnyttjas i många nedströms applikationer, inklusive RT-qPCR, RNA-Seq, Western blot analys, och HPLC.
Denna metod har använts för att utforska molekylära förändringar inom de limbiska systemen hos perinatala gnagare som exponeras för THC och andra cannabinoider för att bättre förstå hur dessa läkemedel kan påverka hjärnans utveckling.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
