Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolasjon og kultur av menneskelige modne adipocytter ved hjelp av membran modne adipocyte aggregerte kulturer (MAAC)
Chapters
Summary February 13th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Membran moden adipocyte aggregat kultur (MAAC) er en ny metode for å kultur modne menneskelige adipocytes. Her beskriver vi hvordan du isolerer adipocytter fra menneskelig fett og hvordan du setter opp MAAC.
Transcript
En utfordring innen fettbiologi har vært å opprettholde moden adipocyte i kulturen. Vi har utviklet en ny metode som gjør det mulig å studere langsiktig adipocyte gjennom store endringer. Vår adipocyte kultur teknikk tillater studiet av celle interaksjoner og vil forhåpentligvis være nyttig for utvikling av nye behandlinger for diabetes og fedme.
Det er viktig å følge protokollen nøye, da det er noen kritiske skritt som i stor grad påvirker genkvaliteten og levedyktigheten til de modne adipocytter. For eksempel, før plating sørg for at alle gratis lipid og vask buffer er fjernet ellers lipocytter kan rive av når innsatsene er invertert. Etter å ha mottatt den menneskelige subkutane fettvevsprøven, legg vevet i et sterilt biologisk sikkerhetsskap i en 15 centimeter petriskål.
Et lite volum medium 199 til parabolen. Bruk pinsett for å forstå store fibrotiske kar i vevet og bruk baksiden av spissen av en lukket saks for å forsiktig skrape fettet langs fartøyet for å frigjøre adipocytter. Når alle cellene er samlet kaste de store bitene av fibrotisk vev og veie trimmet fett.
For ytterligere å frigjøre cellene fra fettvevet, overfør 10 gram fettvev til en ny 15 centimeter petriskål og bruk buet saks til å forsiktig hakke fettet til det blir en jevn homogen blanding uten store biter av fett. Når alt fettet er behandlet, bruk en skje til å overføre 10 milliliter hakket vev til individuelle 50 milliliter rør og tilsett 30 milliliter fordøyelsesbuffer til hvert rør. Plasser deretter rørene i en ristende inkubator ved 37 grader Celsius og 150 rotasjoner per minutt i 30 til 35 minutter.
Fordøyelsen er komplett når fettløsningen er homogen, aprikosfarget og fraværende av store stykker. På slutten av fordøyelsen, dekantere fordøyd fett løsning i en 250 mikrometer mesh filter inne i en trakt satt i steril en liter kolbe. Når hele volumet av adipocytt suspensjon har blitt unnsluppet, forsiktig presse mesh filteret for å øke utbyttet av adipocytter og vaske filteret med 50 til 100 milliliter vaskebuffer før klemme filteret igjen.
Overfør den isolerte adipocyttløsningen til en separasjonstrakte og legg til vaskebuffer til trakten er nesten helt fylt. Snu trakten forsiktig et par ganger for å blande adipocyttsuspensjonen med bufferen og la suspensjonen stå i to til tre minutter til det er en distinkt separasjon av lagene. Når lagene er separert, åpner du dysen på trakten og unnviker sakte bunnoppløsningen i en steril kolbe.
Når alle kollagenase er fjernet, samle renset moden adipocytt løsning i 50 milliliter koniske rør og lett pakke cellene ved sentrifugering. Deretter bruker du en 10 ml sprøyte utstyrt med en 18 gauge kanyle for å fjerne den gjenværende vaskebufferen under adipocyttfjæringen og bruk en pipette til å fjerne det frie lipidlaget som flyter over de modne adipocytter. For såing av modne adipocytter, plasser den gjennomtrengelige membraninnsatskomponenten opp ned på en steril overflate og forsiktig inverter rørene til pakkede adipocytter et par ganger for å sikre en jevn fordeling av celler.
Bruk en bred pipettespiss til å tilsette 30 mikroliter med pakkede modne adipocytter på hver membran. Inverter innsatspanelet i en jevn bevegelse slik at de seedede adipocytter er på bunnen av innsatsene. Plasser panelet av innsatser i en 24 brønnplate som inneholder 500 til 1000 mikroliter med komplett 37 grader Celsius medium per brønn.
Deretter dekker platen og legger platen forsiktig i en vevskultur inkubator. Hver sjuende dag med kultur, erstatte mediet via cutout hullet i hver innsats. Etter en uke med kultur opprettholder modne adipocyttaggregater isolert fra subkutant fettvev den karakteristiske uilokulære lipiddråpemorfologien som bare observeres i modne adipocytter.
Behandling med PPAR-GAMMA-agonister pioglitazon og rosiglitazon resulterer i et økt uttrykk i PPAR-GAMMA responsive gener, mens behandling med glukokortikoidreseptoragonist deksametason ikke har noen effekt på disse genene. På samme måte driver glukokortikoidreseptoragonisten robust genuttrykket av glukokortikoidreseptormålgener, mens PPAR-GAMMA-agonistene ikke har noen signifikant effekt på disse genene. I tillegg induserer syv dagers behandling med PPAR-GAMMA-agonistene robust genuttrykket til det brune fettspesifikke genet, UCP1.
Vår nye adipocytt in vitro modell kan brukes til funksjonelle studier i modne adipocytter, inkludert glukoseopptak, lipogenese, og lipolyse. Med denne nye adipocyte kultur teknikken har vi vært i stand til å vise at menneskelige modne hvite adipocytter kan transdifferentiate til brun-lignende adipocytter.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
