Immunology and Infection
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Séparation de l’enveloppe cellulaire pour les bactéries Gram-négatives dans les fractions de membrane intérieure et extérieure avec des ajustements techniques pour Acinetobacter baumannii
Chapters
Summary April 10th, 2020
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Les bactéries gram-négatives produisent deux membranes spatialement séparées. La membrane externe est divisée de la membrane interne par un périplasme et une couche peptidoglycan. La capacité d’isoler les bilayers doubles de ces microbes a été critique pour comprendre leur physiologie et leur pathogénie.
Transcript
L’étude de la façon dont les microbes régulent la composition chimique des bicouches individuelles éclairera nos connaissances sur les mécanismes de mise à mort des antibiotiques, de résistance aux antimicrobiens et de pathogénie des maladies. Cette technique divise l’enveloppe cellulaire des bactéries gramnégatives en deux fractions définies sans utiliser de détergent. Par conséquent, les lipides, les protéines et les sucres peuvent être évalués dans un environnement semi-indigène.
Certaines étapes dépendent du temps et nécessitent une concentration et une coordination. Initialement, utilisez un ou deux échantillons. Lorsque le niveau de confort augmente, plus d’échantillons peuvent être ajoutés.
Pas plus de six échantillons doivent être manipulés à la fois. Il s’agit d’une procédure de plusieurs jours et les points de contrôle visuels sont utiles pour évaluer l’efficacité et l’erreur. Avant d’effectuer ces étapes parfois finales.
Stries les bactéries des stocks congelés de glycérol sur les plaques d’agar frais. Une fois que les colonies se développent, stockez les plaques à quatre degrés Celsius. Utilisez une seule colonie pour inoculer un tube de cinq millilitres rempli de bouillon et de la culture de la bactérie comme désiré pendant la nuit.
Le dos dilue la culture bactérienne nocturne en un litre du bouillon préféré et incuber les flacons. Lorsque la densité optique désirée a été atteinte, retirez les flacons de l’incubateur et placez-les sur la glace. Mesurer la densité optique de la culture à 600 nanomètres et calculer le volume de culture qui équivaut entre six et huit fois 10 à la onzième colonie bactérienne formant des unités.
Ajoutez ce volume de culture à un tube de centrifugeuse et assurez-vous que les cultures restantes restent sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient utilisées. Pelleter les bactéries par centrifugation pendant 10 minutes ina un angle fixe, centrifugeuse à grande vitesse à 7000 à 10 000 fois G et quatre degrés Celsius. Décanter soigneusement le surnatant et le jeter.
Resuspendez chaque granulé cellulaire en 12,5 millilitres de tampon A.Ajoutez une barre magnétique à remuer à la suspension cellulaire. Ajouter 180 microlitres de 10 milligrammes par millilitre de lysozyme à chaque resuspension cellulaire. Après avoir recueilli le lysozyme EDTA traité bactéries par centrifugation, ajouter rapidement l’inhibiteur de la protéase, chlorure de magnésium et nucléase à la bactérie et de résuspendre rapidement les cellules dans le tampon B.Stir pendant deux minutes, en gardant les suspensions sur la glace.
Ensuite, ajoutez 12,5 millilitres de solution EDTA de 1,5 millimolaire à chaque suspension cellulaire et continuez à remuer sur la glace pendant sept minutes supplémentaires. Décanter les suspensions en tubes coniques de 15 millilitres. Centrifugeuse les suspensions à 9000 à 11 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez les supernatants dans un contenant de déchets biorisques et conservez les granulés sur la glace. Ajouter 25 millilitres de tampon B à chaque granule cellulaire. Ajouter ensuite 55 microlitres d’un chlorure de magnésium molaire, un microlitre d’arnse/dnase/réagage nucléase et un microlitre de cocktail inhibiteur de la protéase.
Resuspendre les granulés dans le mélange. Pipette et vortex vigoureusement jusqu’à ce que les solutions semblent homogènes. Conserver les suspensions sur la glace.
Versez l’échantillon dans le cylindre d’échantillon homogénéisant et amenez la cellule à 20 000 PSI. Pour éviter l’aérosolisation des agents pathogènes, conditionner l’appareil pressurisé dans le tampon B et ajuster les niveaux de pression avant d’ajouter une suspension bactérienne. Engagez la cellule de pression et faites allusion à 10 millilitres de tampon B par mesure de précaution.
Recueillir la lysate cellulaire dans des tubes coniques de 50 millilitres sur la glace tout en gardant les échantillons sur la glace. Pour obtenir une lyse complète, répétez ce processus trois à cinq fois. Pour granuler le matériel cellulaire restant intact, centrifuger les échantillons bactériens lysés à 6, 169 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Répartir les supernatants qui contiennent maintenant les membranes homogénéisées, dans des bouteilles en polycarbonate pour l’ultracentrifugation. Ultracentrifugeuse la cellule lyse à 184, 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant au moins une heure. Jeter les supernatants et conserver les granulés membranaires sur la glace.
À l’aide d’un verre, l’homogénéisateur Dounce résusque les granulés membranaires en un millilitre de la solution de gradient de saccharose isopycnique de faible densité. Ensuite, utilisez un verre, pipette Pasteur pour transférer l’échantillon homogénéisé à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et placer le tube sur la glace. Pour préparer le gradient de saccharose, maintenez un tube Open-Top en polypropylène ou ultra-clair en position légèrement inclinée.
Ajouter lentement deux millilitres de la solution de saccharose de densité plus élevée. Ajouter ensuite quatre millilitres de la solution de saccharose de faible densité. Lors de la préparation du gradient de densité, ajouter la solution saccharose lentement pour éviter de mélanger les couches.
Les couches de saccharose doivent être légèrement visibles et semblent généralement définies. Ensuite, ajoutez la fraction totale de membrane qui a été précédemment résuspendue dans un millilitre de basse densité, solution isopycnique de saccharose. Enfin, remplissez le reste du tube en ajoutant environ six millilitres de la solution de gradient de saccharose isopycnique de faible densité.
Ultracentrifugeuse les échantillons à l’aide d’un rotor balançant à 288 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 16 à 23 heures. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette P1000 à environ cinq millilitres du point. Une fois la centrifugation terminée, utilisez la pipette pour enlever la couche supérieure brune du tube.
Transférer cette couche, qui contient la fraction de la membrane interne, dans une bouteille en polycarbonate pour l’ultracentrifugation. Laissez environ deux millilitres de la solution de saccharose au-dessus de l’interface entre le saccharose de 53% et le saccharose de 73% pour s’assurer que la fraction inférieure, blanche et externe de membrane ne traverse pas la fraction interne de membrane. Encore une fois à l’aide d’une pointe de pipette P1000 dont l’extrémité est enlevée, retirez la couche de membrane externe et transférez-la dans une bouteille en polycarbonate.
Remplissez le vide restant de la bouteille de polycarbonate avec le tampon isolé de stockage de membrane et mélangez par inversion ou pippetting. Conservez les échantillons sur la glace. Pour recueillir les membranes, ultracentrifugez les bouteilles en polycarbonate à 184, 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant une heure.
Enfin, jetez les supernatants et ajoutez 500 à 1000 microlitres de tampon de stockage. Resuspendez les membranes par homogénéisation de Dounce. Prélever les échantillons dans deux tubes de microcentrifugeuse millilimétriques.
Des granules de membrane totaux ont été grattés, Dounce homogénéisé et ultracentrifugé au-dessus des gradients de densité de saccharose pour séparer les membranes intérieures et externes. Un gradient de densité de saccharose de 20%53%73% était suffisant pour diviser certaines souches bactériennes. Mais pas pour le partitionnement a.baumannii qui a été partitionné avec succès en utilisant un gradient de 20%45%73%.
Pour évaluer l’efficacité de la séparation, des échantillons de membrane ont été examinés pour la déshydrogénase de NADH, une enzyme située dans la membrane interne bactérienne. Une diminution de la densité optique à 340 nanomètres a indiqué la présence de l’enzyme. La densité optique a été mesurée pour 50 échantillons de microgrammes de fractions de membrane intérieure et externe de type sauvage S.typhimurium, E.coli K12 DH5a et mutant galE S.typhimurium.
Une concentration plus élevée de protéine a été ajoutée en assayant la pureté des fractions de membrane d’A.baumannii parce qu’un essai initial utilisant 50 microgrammes a suggéré que les niveaux relatifs de déshydrogénase de NADH étaient inférieurs pour A.baumannii que pour les autres souches bactériennes. Pour évaluer la contamination croisée des fractions de membrane interne par des fractions de membrane externe, LPS et LOS ont été extraits et visualisés. Les extraits ont été chargés sur un gel de polyacrylamide et tachés de Pro-Q Emerald 300.
Acinetobacter baumannii est une priorité absolue, multirésistante, pathogène humaine. Ce protocole devrait aider les chercheurs à comprendre les rôles des lipooligosaccharides, des phospholipides et des lipoprotéines dans les mécanismes de résistance et de virulence de cet agent pathogène unique et important. Cette méthode est idéale pour l’analyse en aval des phospholipides, des glucides glycolipides, des protéines et des petites molécules qui existent généralement dans les deux membranes des bactéries gramnégatives.
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