Immunology and Infection
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Trennung der Zellhülle für gramnegative Bakterien in innere und äußere Membranfraktionen mit technischen Anpassungen für Acinetobacter baumannii
Chapters
Summary April 10th, 2020
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Gramnegative Bakterien produzieren zwei räumlich getrennte Membranen. Die äußere Membran wird durch ein Periplasma und eine Peptidoglykanschicht von der inneren Membran abgetrennt. Die Fähigkeit, die beiden Doppelschichten dieser Mikroben zu isolieren, war entscheidend für das Verständnis ihrer Physiologie und Pathogenese.
Transcript
Die Untersuchung, wie Mikroben die chemische Zusammensetzung der einzelnen Doppelschichten regulieren, wird unser Wissen über Mechanismen der Antibiotika-Tötung, antimikrobiellen Resistenz und Krankheitspathogenese informieren. Diese Technik teilt die Zellhülle von gramnegativen Bakterien in zwei definierte Fraktionen ohne Waschmittel auf. Daher können die Lipide, Proteine und Zucker in einer Umgebung beurteilt werden, die halbnativ ist.
Einige der Schritte sind zeitabhängig und erfordern Fokus und Koordination. Verwenden Sie zunächst ein oder zwei Beispiele. Wenn der Komfort steigt, können mehr Proben hinzugefügt werden.
Es sollten nicht mehr als sechs Proben gleichzeitig behandelt werden. Dies ist ein mehrtägiges Verfahren und visuelle Checkpoints sind hilfreich, um Wirksamkeit und Fehler zu bewerten. Bevor Sie dies manchmal letzte Schritte ausführen.
Die Bakterien aus gefrorenen Glyzerinbeständen auf frische Agarplatten aufbrechen. Sobald sich Kolonien entwickeln, lagern Sie die Platten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine einzige Kolonie, um eine fünf Milliliter-Röhre mit Brühe Medien gefüllt zu impfen und kulturieren Sie die Bakterien wie gewünscht über Nacht.
Die über Nacht bakterielle Kultur wieder in einen Liter der bevorzugten Brühemedien verdünnen und die Kolben inkubieren. Wenn die gewünschte optische Dichte erreicht ist, entfernen Sie die Kolben aus dem Inkubator und legen Sie sie auf Eis. Messen Sie die optische Dichte der Kultur mit 600 Nanometern und berechnen Sie das Kulturvolumen, das zwischen sechs und acht mal 10 bis zu den elften bakteriellen Koloniebildenden Einheiten entspricht.
Fügen Sie dieses Kulturvolumen zu einem Zentrifugenrohr hinzu und stellen Sie sicher, dass die verbleibenden Kulturen auf Eis bleiben, bis sie verwendet werden. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation für 10 Minuten in einem festen Winkel, Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 7,000 bis 10, 000 mal G und vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn.
Setzen Sie jedes Zellpellet in 12,5 Milliliter Puffer A.Add einen magnetischen Rührbalken zur Zellsuspension aus. Fügen Sie 180 Mikroliter von 10 Milligramm pro Milliliter Lysozym zu jeder Zellresuspension hinzu. Nach dem Sammeln der Lysozym EDTA behandeltbakterien durch Zentrifugation, schnell den Protease-Inhibitor, Magnesiumchlorid und Nuklease zu den Bakterien hinzufügen und schnell die Zellen in Puffer B.Stir für zwei Minuten wieder suspendieren, halten die Suspensionen auf Eis.
Als nächstes fügen Sie 12,5 Milliliter 1,5 Milliliter 1,5 Millimolar EDTA-Lösung zu jeder Zelle Wiedersuspension und weiter rühren auf Eis für weitere sieben Minuten. Dekantiert die Suspensionen in 15 Milliliter konische Röhren. Zentrifugieren Sie die Suspensionen bei 9.000 bis 11.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie die Überstoffe in einem Biorisiko-Abfallbehälter und behalten Sie die Pellets auf Eis. Fügen Sie jedem Zellpellet 25 Milliliter Puffer B hinzu. Dann 55 Mikroliter eines mollaren Magnesiumchlorids, einen Mikroliter Rnase/Dnase/Nuklease-Reagenz und einen Mikroliter Proteasehemmer-Cocktail hinzufügen.
Die Pellets in der Mischung wieder aussetzen. Kräftig Pipette und Wirbel, bis die Lösungen homogen erscheinen. Bewahren Sie die Aufhängungen auf Eis auf.
Gießen Sie die Probe in den Homogenisator-Probenzylinder und bringen Sie die Zelle auf 20.000 PSI. Um die Aerosolisierung von Krankheitserregern zu vermeiden, konditionieren Sie das Druckgerät in Puffer B und passen Sie die Druckpegel an, bevor Sie eine bakterielle Suspension hinzufügen. Engagieren Sie die Druckzelle und zeigen Sie vorsorglich 10 Milliliter Puffer B an.
Sammeln Sie die Zelle lysieren in 50 Milliliter konische Röhren auf Eis, während auch die Proben auf Eis zu halten. Um eine vollständige Lyse zu erreichen, wiederholen Sie diesen Vorgang drei- bis fünfmal. Um das verbleibende, intakte Zellmaterial zu pellet, zentrifugieren Sie die lysierten Bakterienproben bei 6, 169 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Verteilen Sie die Überstandmittel, die nun die homogenisierten Membranen enthalten, in Polycarbonatflaschen zur Ultrazentrifugation. Ultrazentrifugieren Sie die Zelle lysiert bei 184, 500 mal G und vier Grad Celsius für mindestens eine Stunde. Entsorgen Sie die Überräube und behalten Sie die Membranpellets auf Eis.
Mit einem Glas, Dounce Homogenisator, setzen Sie die Membranpellets in einem Milliliter der isopycnischen Saccharose-Gradientenlösung mit geringer Dichte wieder auf. Dann verwenden Sie ein Glas, Pasteur Pipette, um die Probe homogenat auf eine 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu übertragen und legen Sie die Röhre auf Eis. Zur Vorbereitung des Saccharosegradienten halten Sie ein Polypropylen oder ein ultraklares Open-Top-Rohr in leicht geneigter Position.
Fügen Sie langsam zwei Milliliter der Saccharoselösung mit höherer Dichte hinzu. Dann fügen Sie vier Milliliter der Saccharoselösung mit niedrigerer Dichte hinzu. Bei der Vorbereitung des Dichtegradienten fügen Sie die Saccharoselösung langsam hinzu, um das Mischen der Schichten zu vermeiden.
Die Saccharose-Schichten sollten leicht sichtbar sein und allgemein definiert erscheinen. Als nächstes fügen Sie die gesamte Membranfraktion hinzu, die zuvor in einem Milliliter niedriger Dichte, Isopycnic-Saccharoselösung, resuspendiert wurde. Schließlich füllen Sie den Rest des Rohres, indem Sie etwa sechs Milliliter der niedrigen Dichte, Isopycnic Saccharose Gradient Lösung hinzufügen.
Ultrazentrifugieren Sie die Proben mit einem schwingenden Schaufelrotor bei 288, 000 mal G und vier Grad Celsius für 16 bis 23 Stunden. Schneiden Sie das Ende von einer P1000 Pipettenspitze etwa fünf Milliliter vom Punkt. Nachdem die Zentrifugation abgeschlossen ist, verwenden Sie die Pipette, um die obere, braune Schicht aus dem Rohr zu entfernen.
Übertragen Sie diese Schicht, die die innere Membranfraktion enthält, in eine Polycarbonatflasche zur Ultrazentrifugation. Lassen Sie etwa zwei Milliliter der Saccharoselösung über der Schnittstelle zwischen der 53%Saccharose und der 73%Saccharose, um sicherzustellen, dass die untere, weiße, äußere Membranfraktion die innere Membranfraktion nicht kreuzt. Wieder mit einer P1000 Pipettenspitze mit dem Ende entfernt, entfernen Sie die äußere Membranschicht und übertragen Sie sie in eine Polycarbonat-Flasche.
Füllen Sie die restliche Lücke der Polycarbonatflasche mit isoliertem Membranspeicherpuffer und mischen Sie sie durch Inversion oder Rohrleitung. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf. Um die Membranen zu sammeln, ultrazentrieren Sie die Polycarbonatflaschen bei 184, 500 mal G und vier Grad Celsius für eine Stunde.
Schließlich entsorgen Sie die Überstande und fügen Sie 500 bis 1.000 Mikroliter Speicherpuffer hinzu. Setzen Sie die Membranen durch Dounce Homogenisierung aus. Sammeln Sie die Proben in zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhren.
Totalmembranpellets wurden abgekratzt, Dounce homogenisiert und ultrazentrifugiert über Saccharosedichtegradienten, um die innere und äußere Membranezutrennung zu trennen. Ein Saccharosedichtegradient von 20%53%73% reichte aus, um einige Bakterienstämme zu partitionieren. Aber nicht für die Partitionierung von A.baumannii, die erfolgreich mit einem 20%45%73%Gradient partitioniert wurde.
Um die Wirksamkeit der Trennung zu beurteilen, wurden Membranproben auf NADH-Dehydrogenase getestet, ein Enzym, das sich in der bakteriellen inneren Membran befindet. Eine Abnahme der optischen Dichte bei 340 Nanometern deutete auf das Vorhandensein des Enzyms hin. Die optische Dichte wurde für 50 Mikrogrammproben von inneren und äußeren Membranfraktionen vom Wildtyphimurium, E.coli K12 DH5a und galE mutant S.typhimurium gemessen.
Eine höhere Konzentration von Protein wurde hinzugefügt, wenn die Reinheit der A.baumannii Membranfraktionen, weil ein erster Test mit 50 Mikrogramm darauf hindeutet, dass die relativen Konzentrationen von NADH-Dehydrogenase waren niedriger für A.baumannii als für die anderen Bakterienstämme. Zur Beurteilung der Kreuzkontamination der inneren Membranfraktionen mit äußeren Membranfraktionen wurden LPS und LOS extrahiert und visualisiert. Die Extrakte wurden auf ein Polyacrylamid-Gel geladen und mit Pro-Q Emerald 300 gebeizt.
Acinetobacter baumannii ist eine top-Priorität, multi-medikamentös resistent, menschliche Krankheitserreger. Dieses Protokoll sollte Forschern helfen, die Rolle von Lipooligosacchariden, Phospholipiden und Lipoproteinen in den Resistenz- und Virulenzmechanismen dieses einzigartigen und wichtigen Erregers zu verstehen. Diese Methode ist ideal für die nachgeschaltete Analyse von Phospholipiden, Glycolipiden Kohlenhydraten, Proteinen und kleinen Molekülen, die typischerweise innerhalb der Dualmembranen gramnegativer Bakterien existieren.
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