Immunology and Infection
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Separazione dell'involucro cellulare per i batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interne ed esterne con regolazioni tecniche per Acinetobacter baumannii
Chapters
Summary April 10th, 2020
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I batteri Gram-negativi producono due membrane selvadenti spazialmente. La membrana esterna è partizionata dalla membrana interna da un periplasma e da uno strato peptidoglycan. La capacità di isolare i doppi bistrati di questi microbi è stata fondamentale per comprendere la loro fisiologia e patogenesi.
Transcript
Studiare come i microbi regolano la composizione chimica dei singoli bistrati informerà la nostra conoscenza dei meccanismi di uccisione degli antibiotici, resistenza antimicrobica e patogenesi della malattia. Questa tecnica divide l'involucro cellulare dei batteri gram-negativi in due frazioni definite senza utilizzare detergente. Pertanto, i lipidi, le proteine e gli zuccheri possono essere valutati in un ambiente semi-nativo.
Alcuni passaggi dipendono dal tempo e richiedono concentrazione e coordinamento. Inizialmente, utilizzare uno o due campioni. Quando il proprio livello di comfort aumenta, è possibile aggiungere più campioni.
Non più di sei campioni devono essere maneggiati contemporaneamente. Questa è una procedura di più giorni e i checkpoint visivi sono utili per valutare l'efficacia e l'errore. Prima di eseguire questo a volte i passaggi finali.
Striare i batteri dalle scorte di glicerolo congelato su piastre di agar fresche. Una volta che le colonie si sviluppano, conservare le piastre a quattro gradi Celsius. Usa una singola colonia per inoculare un tubo da cinque millilitri pieno di mezzi di brodo e coltura dei batteri come desiderato durante la notte.
Diluire la coltura batterica durante la notte in un litro del mezzo di brodo preferito e incubare i contenitori. Una volta raggiunta la densità ottica desiderata, rimuovere i contenitori dall'incubatore e posizionarli sul ghiaccio. Misurare la densità ottica della coltura a 600 nanometri e calcolare il volume di coltura che è equivalente tra sei e otto volte 10 all'undicesima colonia batterica che forma unità.
Aggiungere questo volume di coltura a un tubo di centrifuga e assicurarsi che le colture rimanenti rimangano sul ghiaccio fino a quando non devono essere utilizzate. Pellet i batteri per centrifugazione per 10 minuti in un angolo fisso, centrifuga ad alta velocità a 7.000 a 10.000 volte G e quattro gradi Celsius. Decantare con cura il supernatante e scartarlo.
Resuspend ogni pellet di cella in 12,5 millilitri di tampone A.Aggiungere una barra di agitazione magnetica alla sospensione cellulare. Aggiungere 180 microlitri da 10 milligrammi per millilitro lysozima a ciascuna resuspensione cellulare. Dopo aver raccolto i batteri trattati con lysozima EDTA mediante centrifugazione, aggiungere rapidamente l'inibitore della proteasi, il cloruro di magnesio e la nucleasi ai batteri e rimescolare rapidamente le cellule nel tampone B.Stir per due minuti, mantenendo le sospensioni sul ghiaccio.
Successivamente, aggiungere 12,5 millilitri di soluzione EDTA da 1,5 millimolare a ciascuna ri-sospensione cellulare e continuare a mescolare sul ghiaccio per altri sette minuti. Decantare le sospensioni in tubi conici da 15 millilitri. Centrifugare le sospensioni da 9.000 a 11.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare i supernatanti in un contenitore di rifiuti a rischio biologico e trattenere i pellet sul ghiaccio. Aggiungere 25 millilitri di tampone B a ogni pellet di cella. Quindi, aggiungere 55 microlitri di un cloruro di magnesio molare, un microlitro di reagente di rnasi/dnasi/nucleasi e un microlitro di cocktail inibitore della proteasi.
Rimosogliere i pellet nella miscela. Pipetta e vortice vigorosamente fino a quando le soluzioni non appaiono omogenee. Conservare le sospensioni sul ghiaccio.
Versare il campione nel cilindro del campione dell'omogeneizzatore e portare la cella a 20.000 PSI. Per evitare l'aerosolizzazione degli agenti patogeni, condizionare l'apparato pressurizzato nel tampone B e regolare i livelli di pressione prima di aggiungere sospensioni batteriche. Innestare la cella di pressione e alludare 10 millilitri del tampone B per precauzione.
Raccogliere il lisato cellulare in tubi conici da 50 millilitri sul ghiaccio mantenendo anche i campioni sul ghiaccio. Per ottenere unalisi completa, ripetere questo processo da tre a cinque volte. Per pellettare il materiale cellulare rimanente, intatto, centrifugare i campioni batterici llysed a 6, 169 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Distribuire i supernaganti che ora contengono le membrane omogeneizzate, in bottiglie in policarbonato per l'ultracentrifugazione. Ultracentrifugo la cellula si lumaca a 184, 500 volte G e quattro gradi Celsius per almeno un'ora. Scartare i supernatanti e trattenere i pellet di membrana sul ghiaccio.
Utilizzando un bicchiere, l'omogeneizzatore Dounce, rimescola il pellet di membrana in un millilitro della soluzione di gradiente di saccarosio isopiconico a bassa densità. Quindi, utilizzare una pipetta pasteur in vetro per trasferire l'omogeneato del campione in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e posizionare il tubo sul ghiaccio. Per preparare il gradiente di saccarosio, tenere un tubo Open-Top in polipropilene o Ultra-clear in posizione leggermente inclinata.
Aggiungere lentamente due millilitri della soluzione di saccarosio ad alta densità. Quindi aggiungere quattro millilitri della soluzione di saccarosio a densità inferiore. Quando si prepara il gradiente di densità, aggiungere lentamente la soluzione di saccarosio per evitare di mescolare gli strati.
Gli strati di saccarosio devono essere leggermente visibili e apparire generalmente definiti. Successivamente, aggiungere la frazione totale di membrana che è stata precedentemente rimosopensata in un millilitro di soluzione di saccarosio isopiconico a bassa densità. Infine, riempire il resto del tubo aggiungendo circa sei millilitri della soluzione di gradiente di saccarosio isopiconico a bassa densità.
Ultracentrifugare i campioni utilizzando un rotore a benna oscillante a 288.000 volte G e quattro gradi Celsius per 16-23 ore. Tagliare l'estremità di una punta della pipetta P1000 a circa cinque millilitri dal punto. Al termine della centrifugazione, utilizzare la pipetta per rimuovere lo strato superiore marrone dal tubo.
Trasferire questo strato, che contiene la frazione interna della membrana, in una bottiglia di policarbonato per l'ultracentrifugazione. Lasciare circa due millilitri della soluzione di saccarosio al di sopra dell'interfaccia tra il 53% di saccarosio e il saccarosio al 73% per garantire che la frazione inferiore, bianca ed esterna della membrana non attraversi la contaminazione della frazione interna della membrana. Sempre utilizzando una punta di pipetta P1000 con l'estremità rimossa, rimuovere lo strato esterno della membrana e trasferirlo in una bottiglia di policarbonato.
Riempire il vuoto rimanente della bottiglia di policarbonato con tampone di stoccaggio a membrana isolato e mescolare per inversione o pippetting. Conservare i campioni sul ghiaccio. Per raccogliere le membrane, ultracentrifugare le bottiglie in policarbonato a 184, 500 volte G e quattro gradi Celsius per un'ora.
Infine, scartare i supernatanti e aggiungere da 500 a 1.000 microlitri di buffer di archiviazione. Rimescolare le membrane mediante omogeneizzazione dounce. Raccogliere i campioni in due tubi di microcentrifugo millilitro.
I pellet totali di membrana sono stati raschiati, dounce omogeneizzati e ultracentrifugati su gradienti di densità di saccarosio per separare le membrane interne ed esterne. Un gradiente di densità di saccarosio del 20%53%73% era sufficiente per dividere alcuni ceppi batterici. Ma non per il partizionamento A.baumannii che è stato partizionato correttamente utilizzando una sfumatura del 20%45%73%..
Per valutare l'efficienza della separazione, sono stati testati campioni di membrana per la NADH deidrogenasi, un enzima situato nella membrana interna batterica. Una diminuzione della densità ottica a 340 nanometri ha indicato la presenza dell'enzima. La densità ottica è stata misurata per campioni di 50 microgrammi di frazioni di membrana interna ed esterna di tipo selvatico S.typhimurium, E.coli K12 DH5a e galE mutante S.typhimurium.
Una maggiore concentrazione di proteine è stata aggiunta quando si saggia la purezza delle frazioni della membrana A.baumannii perché un test iniziale con 50 microgrammi ha suggerito che i livelli relativi di NADH deidrogenasi erano più bassi per A.baumannii che per gli altri ceppi batterici. Per valutare la contaminazione incrociata delle frazioni della membrana interna con frazioni esterne della membrana, LPS e LOS sono stati estratti e visualizzati. Gli estratti sono stati caricati su un gel di poliacrilammide e macchiati con Pro-Q Emerald 300.
Acinetobacter baumannii è un agente patogeno umano altamente prioritario, resistente ai farmaci. Questo protocollo dovrebbe aiutare i ricercatori a comprendere i ruoli di lipooligosaccaridi, fosfolipidi e lipoproteine nei meccanismi di resistenza e virulenza di questo agente patogeno unico e importante. Questo metodo è ideale per l'analisi a valle di fosfolipidi, carboidrati glicolipidi, proteine e piccole molecole che tipicamente esistono all'interno delle due membrane dei batteri gram-negativi.
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