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破壊法を用いた溶液分散無機ナノ粒子の短いペプチド吸着の研究
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Summary April 11th, 2020
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生体分子無機固相相互作用を理解する第一歩は、吸着性吸着を確立することによって評価され得る基本的な物理化学的定数を明らかにする。液相からの吸着は、運動、表面容量、pH、および競合吸着によって制限され、吸着実験を行う前に慎重に検討する必要があります。
Transcript
タンパク質とペプチドと無機材料の相互作用は、ナノテクノロジー、バイオマテリアル、バイオテクノロジーに影響を及ぼす基本的な現象です。このような現象を理解する最初のステップは、吸着定数、ギブス自由エネルギー、エンタルピー、エントロピー、および吸着性吸着を確立することによって評価され得る限定的な吸着などの基本的な物理化学的定数を明らかにすることです。しかし、液相からの吸着は、実験を行う前に意識的に考慮すべき運動、表面容量、pH、および比較吸着によって制限される。
このビデオでは、私の同僚エレナ・コリーナとセルゲイ・ナイフェルトは、関連する実験を行っている間に研究者が直面する可能性のある隠れたリスクを回避するのに役立つ二酸化チタンを覆う準備機能を分散させる溶液に対するジペプチド吸着の物理化学的研究を紹介します。滅菌ポリマー試験管に183ミリグラムのジペプチドを入れ、二重蒸留水で約35ミリリットルまで希釈し、激しい攪拌下で室温で溶解する。ジペプチドが二重蒸留水に溶解せず、攪拌しない場合は、ジペプチド溶液を超音波浴に入れ、数分間超音波処理します。
室温で撹拌し、pHメーターでpHをモニタリングする際に、酵素溶液にMESまたは水酸化ナトリウムの溶液を慎重に添加して、ペプチドの溶解液のpHを7.4に調整します。pHを調整した後、溶液を測定シリンダーに注ぎます。試験管をすすいで、測定シリンダーに40ミリリットルまでの二重蒸留水を充填して、最終的な濃度を16ミリモルにします。
16ミリモルジペプチド溶液を二重蒸留水で希釈することにより、0.4~12ミリモルの濃度でジペプチド希釈液を調製します。例えば、8ミリモルジペプチド溶液を調製するために、16ミリモルジペプチド溶液の10ミリリットルに7ミリリットルの二重蒸留水を加える。希釈後、ジペプチド溶液にMESまたは水酸化ナトリウムの滴溶液を添加してpHを7.4に調整します。
pHを調整した後、測定シリンダーに溶液を注ぎます。試験管をすすいで、測定シリンダーを20ミリリットルまで二重蒸留水で満たし、8ミリモル濃度にします。ジペプチドストック溶液の他の希釈液は、それに応じて調製される。
最終的には、吸着研究の準備ができているジペプチド希釈剤の列を取得します。10 ミリモル MES バッファー溶液を準備します。pHメーターでpHを撹拌し、監視する際に、水酸化三ナトリウムでpHを7.4に調整します。
このソリューションは、唯一の準備に使用されます。約200ミリグラムのナノ結晶性酸化チタンをモルタルで5分間粉砕します。グラインド二酸化チタンナノ粒子の重量を40ミリグラム。
実験室のスタンドを使用して超音波処理浴槽にフラスコを入れてください。ガラス漏斗を使用してフラスコにMESバッファーの20ミリリットルの粉砕二酸化チタンを追加し、20分間超音波浴中で超音波処理します。サーモスタットを希望の温度に設定します。
印付き吸着バイアルに二酸化チタンの超音波ソールの1ミリリットルを追加します。発泡スチロールで作られた即興浮遊装置に対応する希釈に対してマークされた吸着バイアルを置き、少なくとも5分間温度を平衡化するためにサーモスタットに入れます。その後、1ミリリットルのジペプチド希釈を対応する印付き吸着バイアルに加え、すべての混合溶液が同じ温度であることを確認します。
吸着平衡を達成するために、得られた一連の吸着サンプルをサーモスタットに24時間保持します。熱硬化時に酸化チタン分散液を攪拌する場合があります。温度誘発の再平衡を避けるために、一度に濾過のためにサーモスタットから1つのサンプルを取り出す。
各ガラスバイアルからジペプチド溶液のサンプルを注射器で採取する。注射器から針を取り出し、注射器フィルターに入れてジペプチド溶液をガラスバイアルにフィルターします。他の濃度のサンプルでろ過を繰り返します。
これらのサンプルは、分析の準備が整いました。アセトニトリルでTFAの50ミリリットル溶液を作ります.測定シリンダー内のTFAの0.34ミリリットルをスパイクし、室温でアセトニトリルで溶液の体積を50ミリリットルに調整します。
誘導体化ソリューションを準備します。フェニリソチオシアネートの299マイクロリットルをスパイクし、測定シリンダー内のトリエチルアミンの347マイクロリットルをスパイクし、アセトニトリルで50ミリリットルまでシリンダーを充填します。高速液体クロマトグラフィー分析の前に、クロマトグラフィーバイアル内のエドマンの試薬でサンプルを誘導します。
400マイクロリットルの誘導体化試薬とサンプル400マイクロリットルを混合します。サンプルを60度に保ち、15分間保管してください。加熱後、225マイクロリットルのTFA溶液でサンプルを中和し、サンプルを室温まで冷却するために数分待ちます。
HPLC分析を使用して、吸着前後のジペプチド溶液の濃度を決定します。ソフトウェアによって設定された必要な条件でサンプルの分析を開始します。この平衡ジペプチド濃度からの吸着の依存性は吸着後、吸着吸着は得られた実験データに応じてプロットした。
ジペプチド吸着の測定は、ヘンリーモデルを用いて処理されたデータであった。平衡結合定数は、ジペプチド平衡濃度に対するジペプチド吸着の依存性の傾きから得られた。バントホフ方程式は、各温度の標準的なギブス自由エネルギーを決定するために使用されました。
自由エネルギー対温度のグラフでプロットし、ジペプチドの自由エネルギー軸を用いた線形グラフの傍受としてエンタルピーを決定した。各温度のエントロピーの変化は、基本式から求めた。ジペプチドに対する平衡結合定数、標準Gibbs自由エネルギー、エンタルピーおよびエントロピーの計算値を表1に示す。
枯渇データからの吸着アイソマ構造は、高価なセットアップを必要としない最も利用可能な方法論であり、文字通りすべての可溶性ソルベートに対する徹底的な物理化学的データを提供する。分光またはコンピュータベースのデータと組み合わせることで、無機ナノ粒子に接触したときの生体分子の複雑な挙動の基本的な構造的特徴を明らかにすることができる。
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