Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Billedbehandling DPP-udgivelse fra en Drosophila -vinge skive
Chapters
Summary October 30th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Tidspunktet for eksponering for ligander kan påvirke deres udviklingsmæssige konsekvenser. Her viser vi hvordan man billede frigivelse af en Drosophila knogle morfogenetisk protein (BMP) kaldet DPP fra celler i vinge skiven.
Transcript
DPP påvirker cellernes skæbne ved at binde receptorer og sende et signal intracellulært for at påvirke transskriptionen. Hvis DPP produceres, men ikke frigives, har det ikke adgang til receptorer og kan derfor ikke udføre sine roller. Denne teknik gør det muligt at visualisere DPP frigivelse gør det muligt for forskere at undersøge, hvilke genetiske og miljømæssige faktorer ændre DPP frigivelse dynamik.
BMP-signalvejen bevares fra fluer til mennesker, så vi forventer, at den mekanisme, der dikterer DPP-frigivelse, også vil være relevant for menneskelig udvikling og regenerering. Begynd med at krydse 30 til 40 jomfru kvindelige DPP GAL4 fluer med 10 til 15 mandlige UAS DPP-GFP fluer. Tilskynde æglægning ved at tilføje en lille mængde gær pasta til en frisk hætteglas med mad.
For at indsamle æggene, flip de krydsede fluer i hætteglasset og lad dem lægge i tre til fire timer, før du fjerner dem. Hold ægindsamlingshætteglassene ved 25 grader Celsius i ca. 144 timer, indtil larverne er på tredje instarscene. Vælg derefter de relevante larver til dissektion.
Først skal du vælge larver, der er ikke-TB, som vil være normal længde snarere end kort og fedt. Hvis du vil vælge DPP-GFP, der udtrykker larver, skal du se dem under et fluorescenssteremikroskop. Alle ikke-TB larver vil have en vis fluorescens, men GFP er begrænset til vingediske og er mindre lyse på DPP-GFP larver.
Forbered modificerede HL3 medier i henhold til manuskript retninger, som vil holde vingen diske i live til billedbehandling. Juster pH-3 til 7,1 med HEPES, og filtrer den derefter gennem et 0,22 mikrometerfilter. Placer to stykker farveløs dobbeltsidet tape bredde klogt på tværs af et mikroskop dias forlader et mellemrum på omkring fem millimeter mellem dem og sørg for, at enderne af båndet ligger skyllet med kanterne af diaset.
Brug en flad kant til at trykke tapetet fast til sliden. Tilføj 25 mikroliter af de modificerede HL3-medier mellem de to stykker tape. Når vingeskiven er monteret i mediet, vil tapestykkerne forhindre, at den bliver knust af dækslæden.
At dissekere larverne, placere den i den modificerede HL3 medier og forsigtigt rive det i halve ved hjælp af to par saftænt. Kassér den bageste halvdel, derefter gribe midten af den forreste halvdel med et par kraftaffængbånd og bruge det andet par til at skubbe munden kroge tilbage i larven, indtil det er helt omvendt. Kig efter de skarpe bøjninger i de to mørkere farvede primære grene af luftrøret, der løber ned begge sider af larven.
Vingeskiverne ligger lige nedenunder. Fjern forsigtigt skiverne og læg dem i HL3-mediet på det forberedte dias og sørg for, at der stadig ikke er fastgjort stykker af luftrør til skiverne. Arranger vingeskiverne, så den peripodial side af vingeposen vender opad med disken liggende fladt.
Dæk vingen med en dæksel og forsegling med neglelak. Når polerlakken er tør, skal du straks fortsætte med billeddannelse. Billede den monterede vingeskive ved hjælp af en konfokal laserscanning mikroskop med en 40X olie mål og en 488 nanometer laser.
Saml billeder med en hastighed på to hertz i to minutter. For de bedste resultater, indstille laser magt lige stærk nok til at få et klart billede af DPP-releasing celler for at undgå over blegning. Saml billederne som en tidsserie og eksportere dem som AVI-filer for at få en video af DPP frigivelse.
Når protokollen lykkes, vises DPP-GFP som en stribe ned midt på vingeskiven med kerner, der er synlige som ikke-fluorescerende cirkler. DPP-GFP frigivelse er synlig som fluorescerende punktformet, der vises og forsvinder både i og langt væk fra celle organer. De forskellige punktform og er sandsynligvis i cytoner eller ved cytonemes synapser.
Vingeskiverne er monteret, så billeddannelsen udføres fra peripodial siden. Hvis vingeskiven er afbildet fra bagsiden, vises DPP-GFP-fluorescensen uden for fokus, og opløsningen vil være dårlig. Når GFP ikke er smeltet til DPP, observeres der ingen punktform og uden for celleorganerne.
Dette kontrolelement viser, at DPP-GFP opfører sig anderledes end GFP alene. Desuden vises der ingen fluorescerende punktform, når DPP-GFP ikke udtrykkes. Under denne procedure er det vigtigt, at vingeskiven monteres peripodial side op.
Hvis vingeskiven er forkert orienteret, vises DPP-GFP uden fokus. Denne metode kan bruges til at studere frigivelsen af andre udviklingsmæssige signalering ligander som vingeløs eller pindsvin. Vi kan udforske alle de forskellige miljømæssige og genetiske faktorer, der kan påvirke DPP frigivelse.
Derudover kan vi tilpasse denne metode til at studere BMP frigivelse fra andre celletyper.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
