Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Imaging DPP Release fra en Drosophila vinge Disc
Chapters
Summary October 30th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Tidspunktet for eksponering for ligander kan påvirke deres utviklingsmessige konsekvenser. Her viser vi hvordan du bilde utgivelsen av en Drosophila Bone Morfogenetiske PROTEIN (BMP) kalt DPP fra cellene i vingen platen.
Transcript
DPP påvirker celleskjebnen ved å binde reseptorer og sende et signal intracellulært for å påvirke transkripsjon. Hvis DPP er produsert, men ikke utgitt, det har ikke tilgang til reseptorer og derfor ikke kan utføre sine roller. Denne teknikken gjør det mulig å visualisere DPP-utgivelse slik at forskere kan undersøke hvilke genetiske og miljømessige faktorer som endrer DPP-utgivelsesdynamikk.
BMP signalveien bevares fra fluer til mennesker, så vi forventer at mekanismen som dikterer DPP-utgivelsen, også vil være relevant for menneskelig utvikling og regenerering. Begynn med å krysse 30 til 40 jomfrukvinne dpp gal4 fluer med 10 til 15 mannlige UAS DPP-GFP fluer. Oppmuntre egglegging ved å legge til en liten mengde gjærpasta til et nytt hetteglass med mat.
For å samle eggene, snu de kryssede fluene inn i hetteglasset og la dem ligge i tre til fire timer før de fjernes. Hold eggsamlings hetteglassene ved 25 grader Celsius i ca. 144 timer til larvene er på tredje instar-stadium. Velg deretter de riktige larver for disseksjon.
Først velger larver som ikke er TB som vil være normal lengde i stedet for kort og fett. For å velge DPP-GFP som uttrykker larver, se dem under et fluorescensstereomikroskop. Alle ikke-TB larver vil ha noen fluorescens, men GFP er begrenset til vingeplatene og er mindre lyse på DPP-GFP larver.
Forbered modifiserte HL3-medier i henhold til manuskriptretninger som vil holde vingeplatene i live for bildebehandling. Juster pH til 7,1 med HEPES og filtrer den deretter gjennom et 0,22 mikrometerfilter. Plasser to stykker fargeløs dobbeltsidig tapebredde klok over et mikroskop lysbilde forlater et mellomrom på ca fem millimeter mellom dem og sørge for at endene av båndet ligge spylt med kantene på lysbildet.
Bruk en flat kant til å trykke tapen godt til lysbildet. Legg til 25 mikroliter av det modifiserte HL3-mediet mellom de to tapebitene. Når vingeskiven er montert i media, vil tapebitene hindre at den knuses av dekkslippen.
For å dissekere larven, legg den i det modifiserte HL3-mediet og riv den forsiktig i to ved hjelp av to par tang. Kast den bakre halvdelen, ta deretter tak i midten av den fremre halvdelen med ett par tang og bruk det andre paret til å skyve munnkrokene tilbake i larven til den er helt invertert. Se etter de skarpe svingene i de to mørkere primærgrenene av luftrøret som går ned begge sider av larven.
Vingeplatene ligger rett under. Fjern platene forsiktig og legg dem i HL3-mediet på det klargjorte lysbildet, og pass på at ingen stykker luftrør fortsatt er festet til platene. Ordne vingeskivene slik at den peripodiale siden av vingeposen vender oppover med platen liggende flatt.
Dekk vingen med en dekkslipp og forsegle med neglelakk. Når polishen er tørr, fortsett umiddelbart med bildebehandling. Bilde den monterte vingeplaten ved hjelp av et konfokal laserskanningsmikroskop med et 40X oljemål og en 488 nanometer laser.
Samle bilder med en hastighet på to hertz i to minutter. For best resultat, angi laserkraften akkurat sterk nok til å få et klart bilde av DPP-frigjørende celler for å unngå over bleking. Samle bildene som en tidsserie og eksportere dem som AVI-filer for å få en video av DPP-utgivelsen.
Når protokollen er vellykket, vises DPP-GFP som en stripe nedover midten av vingeplaten med kjerner synlig som ikke-fluorescerende sirkler. DPP-GFP-utgivelsen er synlig som fluorescerende punktpunkt som vises og forsvinner både i og langt borte fra cellelegemene. Den distinkte punktta er sannsynlig i cytonemes eller på cytonemes synapser.
Vingeskivene er montert slik at bildet gjøres fra peripodialsiden. Hvis vingeplaten er avbildet fra baksiden, vil DPP-GFP-fluorescensen vises ute av fokus og oppløsningen vil være dårlig. Når GFP ikke er smeltet sammen til DPP, observeres ingen punktpunkt utenfor cellelegemene.
Denne kontrollen viser at DPP-GFP oppfører seg annerledes enn GFP alene. Videre vises ingen fluorescerende punktpunkt når DPP-GFP ikke uttrykkes. Under denne prosedyren er det viktig at vingeskiven er montert peripodial side opp.
Hvis vingeplaten er feil orientert, vises DPP-GFP ute av fokus. Denne metoden kan brukes til å studere utgivelsen av andre utviklingssignalering ligands som vingeløs eller pinnsvin. Vi kan utforske alle de forskjellige miljømessige og genetiske faktorene som kan påvirke DPP-utgivelsen.
I tillegg kan vi tilpasse denne metoden for å studere BMP-frigjøring fra andre celletyper.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
