Biology
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ヘリアンサス・アンヌウスにおける大規模な熱画像スクリーニングによる植物蒸散の新規レギュレーターの同定
Chapters
Summary January 30th, 2020
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化合物ライブラリーの大規模スクリーニングにより、葉面蒸散起のモジュレーターを同定する方法を提供する。
Transcript
このプロトコルは、熱画像を使用して、植物の蒸散を調節できる新しい化合物を同定します。この技術は、試験できる植物種、化合物の性質、およびイメージングの種類に関して汎用性があります。栽培用の植物を設定するには、まず、穴のない標準10×20インチの植物トレイに4センチメートルの厚さの層を追加し、種子ホルダーをトレイに2センチメートル離れて配置します。
シードホルダーにバーミクーライトを充填し、シードの半分が露出したままになるように、各ホルダーに端を向けたヒマワリの種を1つ置きます。すべての種子がメッキされたら、上から水で細かいバーミチュライトと霧の追加の2センチメートルでそれらをカバーします。1時間後、トレイに蓋をして、植物を温室の成長室に置きます。
水耕栽培システムを設定するには、植物を生育するのに適した適切なサイズの容器に蒸留水を充填し、製造業者が示す一般的な水耕栽培肥料を添加します。その後、空気ポンプと水ポンプを使用して、一定の動きで得られる水耕栽培溶液を通気します。水耕栽培フローターを準備するには、厚さ2センチメートルのエキスパンドポリスチレンフォームのシートを容器の寸法にカットし、木材燃焼ツールを使用して泡に直径1〜2センチメートルの穴を作ります。
次に、フローターを水耕栽培システムに入れます。植え付けから5日後、苗をバーミクライトからそっと引き出します。すぐに苗を水の容器に30分間入れ、余分なバーミクーライトを取り除き、残りのペリカルプを柔らかくします。
新しいプライマリ ルートが表示されたら、必要に応じてペリカルプを手で取り除きます。シードホルダー内の苗を、水耕栽培システムで準備されたポリスチレンフォームフローターに移します。2日間水耕栽培で植物を育てます。
小さな化合物ライブラリーの化学物質を室温で解凍します。負の対照処理のための6つのキャップレス2ミリリットルマイクロチューブ、ABA治療のための3つのチューブ、および三重に関心のある20の化学物質の効果を分析するための最後の60チューブにラベルを付けます。各試験管に各化学物質10マイクロリットル、10ミリモルABAとジメチルスルホキシドの10マイクロリットルを3つのABAチューブに加え、10マイクロリットルのジメチルスルホキシドを6つの対照管に加えます。
その後、慎重に各チューブに10ミリモルMES水酸化カリウムの990マイクロリットルを混合します。正と負の制御と、位置に関連するバイアスを考慮してラック内に均等に分布した実験チューブをチューブラックに配置します。サーマルイメージングカメラを設定するには、まずカメラをコピースタンドに取り付け、すべてのケーブルをラップトップに接続します。
ラップトップの電源を入れる前にカメラの電源を入れ、熱画像解析ソフトウェアを開きます。記録パラメータを調整するには、録音ボタンの上にマウスを移動して、[録音設定]の下にあるレンチアイコンを選択し、適切な記録モードとオプションを選択します。苗の処理のために、慎重に種子ホルダーを持ち上げ、急速に水を含む浅い皿に根を浸します。
各苗の一次根を水の下で0.8〜1センチメートルの下に切り、種子ホルダーの最も基底端の下に切り、キャピションを防ぎ、切りたての植物を化学物質の1つのチューブに挿入します。すべての苗が移された場合は、植物を熱画像カメラの下に置き、すべての植物がカメラの視野の範囲内にあることを確認します。カメラをコチルドンの表面に合わせるには、コントロール Alt A を押して[ムービーを録画]をクリックします。
録音を確認する新しいウィンドウが開きます。1~2時間後、録画を停止します。データ分析のために、正しい seq ファイルを開き、ムービーを一時停止します。
目的の3×3ピクセルのアイコンの測定カーソル領域をクリックし、最初の植物のコチルドンの中心にマウスを移動します。画像を左クリックして、コティレドンにラベルを付けます。第1の植物の第2のコチルドンに同じようにラベルを付ける。
すべてのプラントに 2 つのカーソルが付いた状態でラベルが付けられている場合は、目的の編集領域アイコンをクリックし、左クリックして押したままスクロールして、対象の領域をすべて選択します。次に、統計ビューアー アイコンの上にマウスを移動し、時間プロットを選択します。新しいウィンドウが開きます。
ムービーを実行すると、グラフがデータで塗りつぶされます。次に、グラフ ウィンドウで二重矢印をクリックして新しいメニューを開き、保存アイコンをクリックしてデータを保存します。赤い染料エリスロシンBの使用は、10分以内にヒマワリ苗のコチルドンに切り取られた根を通して目に見えて吸収される化学物質の能力を示しています。
植物をABAで処理すると、30分以内にヒマワリのコチルドンで葉の温度の上昇が検出され、口内開口の減少と口内伝導に関連しています。また、10マイクロモルABAで処理後15分、5マイクロモルABAで処理後20分の上葉膜温度が観察され、熱画像による葉の温度の測定が気孔率および導電率を測定するための良好なプロキシであることを実証する。本代表的な実験では、標準的なスコアベースの統計的処理により、口内閉鎖または開口を促進する化学物質の同定が可能となる。
蒸散に及ぼす化合物の影響を測定するには、光、湿度、温度の最適な条件下で植物を育てることが重要です。このプロトコルは、ほとんどのディコに適用できます。また、例えばクロロフィル蛍光を測定することによって、光合成性能に対する新しい化合物の効果を評価するためにも使用できます。
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