Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Antibiyotik Direnci Platformu Kullanarak Antibiyotik Dereplication
Chapters
Summary October 17th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Biz antibiyotik dereplication için izojenik antibiyotiğe dirençli Escherichia coli bir kütüphane kullanan bir platform açıklar. Bakteri veya mantarlar tarafından üretilen bir antibiyotiğin kimliği, kendi direnç genini ifade eden E. coli'nin büyümesi ile ortaya çıkarılabilir. Bu platform ekonomik açıdan etkili ve zaman etkindir.
Transcript
Özel ekipman kullanmadan bilinen antibiyotiklerin hem maliyet etkin hem de zamanında derepiyonu sağlar, çünkü bizim protokol önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı şablon özelleştirmedir. Bu, bir bireyin, istenilen geniş veya dar substrat özgüllüğü düzeyine göre kütüphane şablonuna eklemek istediği direnç genlerini uyarlayabileceği anlamına gelir.
Örneğin, bir beta-laktam e.coli şablonu beta-laktamlar ve çeşitli alt sınıfların son derece özel derepifasyonu için izin vermek için hazırlanabilir ifade ediyor. Bir septik tekniği kullanarak, pipet 500 katyon mikrolitre steril bir rezervuar dan steril bir rezervuar dan steril, 96 derin kuyu plaka her kuyuiçine MHB ayarlı. Hazırlanan ARP veya MARP gerinim plakaları ile, ARP veya MARP haritasına uygun olarak 96 derin kuyu plakasını aşılamak için aplikatör çubuğu kullanın.
Derin kuyu plaka yüzeyine bir nefes sızdırmazlık membran ı yerleştirin ve 37 santigrat derece, 250 RPM gecede kuluçka. Kontamine kuyu olmadığından emin olun. Çok kanallı pipet kullanarak, derin kuyu plakasının her kuyudan 100 mikrolitreyi steril 96 kuyulu yuvarlak alt plakaya aktarın.
Her kuyuya 100 mikrolitre steril %50 gliserol ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı boru lar ekleyerek karıştırın. En az beş kütüphane plakası hazırlayın. Plakaları steril alüminyum contalarla kaplayın ve her kuyunun ayrı ayrı mühürlenmesini sağlayın.
Plaka kapağını alüminyum contanın üzerine yerleştirin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ahşap aplikatör çubuğu kullanarak, bir streptomyces koloniyüzeyinden yavaşça sporlar kazımak ve bir steril cam boncuk ve streptomyces antibiyotik orta üç mililitre içeren bir test tüpü içine aktarın. Havalandırmaya izin vermek için test tüpünü bir kapakla gevşek bir şekilde kapatın.
Aynı ahşap aplikatör çubuğunu kullanarak, Bennett'in agarını içeren bir Petri kabında sterilite kontrolü yerleştirin. Tohum kültürünü içeren tüpü 30 derecede 250 RPM'de altı gün havalandırma ile ve sterilite kontrol plakasını 6 gün boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, düz bir yüzeyde, çoğaltma plakaları hazırlayın.
Bir serolojik pipet içine sıcak Bennett's agar 23 mililitre aspire ve dikdörtgen Petri kabının yüzeyinde eşit 20 mililitre dağıtmak, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için pipet içinde orta kalan bırakarak. Tabağı bir kapakla kapatın. Orta plakanın tüm alanlarını kaplayana kadar plakayı yavaşça döndürün ve agar tamamen ayarlanana kadar onu rahatsız etmeyin.
Daha sonra, dikdörtgen Petri çanak kapağını bir izleme şablonu olarak kullanarak nitroselüloz membran levhaları hazırlayın, böylece yapraklar çoğaltma plakasının yüzeyine uyun. Çarşafları kesin ve steril bir kese içinde otoklavlayın. Şimdi, altı günlük kuluçkadan sonra hiçbir kirletici madde bulunmadığından emin olmak için sterilite kontrol plakasını kontrol edin.
Kontaminasyon yoksa, dikdörtgen Petri kabının kapağını ve tohum kültürünün 200 mikrolitrelik pipetini dikdörtgen çanaktaki Bennett'in agarının yüzeyine çıkarın. Kültürü tüm plakanın yüzeyine eşit olarak yaymak için steril bir pamuklu bez kullanın. Hazırlanan nitroselüloz membranı Petri kabının yüzeyindeki kültürün üzerine konumlandırmak için, membranın alt kenarını Petri kabının alt kenarına hizalayın ve membranı alt kenardan plakanın üst kenarına yavaşça uygulayın.
Membran agar arayüzü arasında oluşmuş olabilecek hava kabarcıklarını düzeltmek için steril pamuklu bir bez kullanın, membranA agar floş olmasını sağlamak. Sekonder metabolitler aşağıdaki ortama atılabilirken membran organizmaların yüzeyinde sporulate sağlar. Kapağı dikdörtgen Petri kabına geri koyun ve ters bir şekilde kapalı bir plastik torbaya koyun.
6 gün boyunca 30 derecede kuluçkaya yat. Altı gün sonra, dereplik plakasını kuvözden çıkarın. Steril cımbız kullanarak, dikkatle Bennett's agar yüzeyinden nitroselüloz membran kaldırın.
Eklenecek kaplamayı kirletme olasılığını azaltmak için plakanın kenarlarında sadece küçük bir spor büyümesi olduğundan emin olun. Çalışma yüzeyinin düz olduğundan emin olun ve 23 mililitre sıcak katyon agar agar aspire etmek için serolojik pipet kullanın. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için agarın geri kalanını pipette bırakarak, çoğaltma plakasının yüzeyine 20 mililitre eşit olarak dağıtarak bir kaplama oluşturun.
Kapağı tabağa yerleştirin. Orta tüm alanları kaplayana kadar plakayı yavaşça döndürün ve agar tamamen ayarlanana kadar onu rahatsız etmeyin. Bir kez soğutulmuş ve katılaşmış, mühürlü plastik torbaya dereplik plakası dönmek ve baş aşağı dört derece santigrat gecede saklamak, MHB agar bindirme içine ikincil metabolitlerin difüzyon için izin.
Aynı gün, 100 mikrolitre katyon ayarlı MHB'yi 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna borulandırarak yeni bir ARP veya MARP şablonuna inoküle edin. Eksi 80 derece santigrat dondurucu dan dondurulmuş stok ARP veya MARP kütüphane plakası atın. Yoğuşma alt tarafında oluşmaya başlamadan önce alüminyum mührü çıkarın.
Steril 96 kuyulu sabitleme araçlarını kullanarak, dondurulmuş stok ARP veya MARP kütüphane plakasından dikkatlice sabitlenin ve 96 kuyulu plakalar içeren taze MHB'yi inceltin. Çoğaltma sırasında kontaminasyonu en aza indirmek için, kitaplık plakası başına yalnızca iki ila üç çoğaltma plakasını çoğaltmak için gereken sayıda ARP veya MARP kitaplık plakası kadar hazırlayın. Tamamlandıktan sonra, dondurulmuş şablon üzerine yeni bir steril alüminyum mühür koymak ve eksi 80 derece Santigrat dondurucu dönmek.
Aşılanmış 96 kuyulu plakaları gevşek bir şekilde kapatılmış bir plastik torbanın içine yerleştirin ve 18 saat boyunca 250 RPM'de sallayarak 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuvözden ARP veya MARP şablonu çıkarın ve plakayı ARP veya MARP şablon haritasıyla karşılaştırarak hiçbir kirletici madde bulunmadığından emin olun. Dereplication plakaları dört santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığına dengede izin verin.
Yoğuşma varsa, kapakları açın ve steril bir ortamda kurumasını bekleyin. Steril sabitleme araçlarını kullanarak, ARP veya MARP kitaplık plakasından dereplik plakalarının MHB agar kaplamasının yüzeyine sabitlenin. Agar'ı delmemeye dikkat et.
Şablon inoculum üç ila beş dakika kurumasını bekleyin. Aşılanmış ayrıştırıcılık plakalarını kapalı bir plastik torbaya ters çevirin ve gece boyunca 37 santigrat derece kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, dereplication plakaüzerindeki büyümeyi ARP veya MARP haritasına karşılık gelen kuyularla karşılaştırarak çoğaltma sonuçlarını analiz edin.
Bu ARP veya MARP dereplication iş akışında, pozitif bir çoğaltma sonucu elde edildi. Wac 8921 için hazırlanan ekstre kloramfenikol üreticisi olarak tanımlanmıştı. ARP büyüme eksikliği ya bilinmeyen bir antibiyotik ya da ARP veya MARP kütüphane plakası hesaba katmadı daha az yaygın olarak bulunan antibiyotik varlığını gösterir.
MARP'ye özgü bir büyüme modeli, hem vahşi tip E.coli BW25113 hem de hiper geçirgen ve e-akı eksikliği mutant E.coli BW25113 bamB tolC'nin kullanımı nedeniyle oluşmuştur. Bu sonuç, bozulmamış bir dış zarı geçemeyen antimikrobiyal aktiviteye sahip bir bileşiğin varlığını göstermektedir. Bu E.coli büyüme desenleri sabitleme araçlarının yanlış sterilizasyonunu göstermektedir, bu da bilinmeyen E.coli suşlarının bindirme boyunca aktarılmasıyla sonuçlanır.
Ve ARP veya MARP dondurulmuş stok kütüphane plaka kirlenme bir örnek burada dikdörtgen Petri çanak yüzeyinde yetiştirilen üç farklı E.coli kolonileri ile gösterilir. Bu sonuç, agar bindirmesinin dereplik sırasında delindiğini gösterir. MHB bindirme ile ilgili kontaminasyon da dereplication işlemi sırasında oluşabilir, bindirme yüzeyinde düzensiz bir büyüme deseni gösteren.
Bu protokolü takip ederken hatırlanması gereken en önemli şey, kontaminasyon nedeniyle herhangi bir adımda geri tutulmamanızı sağlamak için uygun sterilizasyon ve aseptik teknikleri kullanmaktır. Bu, MHB bindirme sini dökerken sporların yayılmasını en aza indirmek için Bennett'in agar plakasının yüzeyine mümkün olduğunca yakın bir şekilde sığacak şekilde nitroselüloz membranının hazırlanmasını içerir. Ayrıca, kütüphane plakalarını aşılarken ve en temiz sonucu elde etmek için çoğaltma yaparken düzgün sterilize edilmiş sabitleme ekipmanı kullanmak da son derece önemlidir.
Bilinen antibiyotiklerin çoğaltılmasına ek olarak, bu yöntem aktivitelerini kurtarmak için mevcut antibiyotiklerle birlikte kullanılabilecek sıfatların belirlenmesinde de uygulanabilir. Antibiyotik dereplik yeni bir teknik olmamasına rağmen, kaynak yoğun ve zaman alıcı olduğu için kötü üne sahiptir. ARP ve MARP platformu antibiyotik dereplik büyük bir üretim olması gerekmez nasıl bir ışık tutmak için yardımcı, ama daha ziyade en az ekipman kullanılarak iki haftalık bir süre içinde tamamlanabilir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
