Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

In vitro-stimulering och visualisering av extracellulär fälla release i differentierade humana Monocyte-derived makrofager

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Journal (Immunology and Infection)

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Journal (Immunology and Infection)

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Click here for the English version

In vitro-stimulering och visualisering av extracellulär fälla release i differentierade humana Monocyte-derived makrofager

Article DOI: 10.3791/60541-v

November 1st, 2019 •

Yunjia Zhang^1,2, Benjamin S. Rayner^1,2, Mathias Jensen³, Clare L. Hawkins^1,2,3

¹Heart Research Institute, ²Sydney Medical School, University of Sydney, ³Department of Biomedical Sciences, University of Copenhagen

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

November 1st, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Presenteras här är ett protokoll för att upptäcka makrofag extracellulära Trap (Met) produktion i levande cellkultur med hjälp av mikroskopi och fluorescens färgning. Detta protokoll kan utökas ytterligare för att undersöka specifika MET-proteinmarkörer genom färgning av immunofluorescensteknik.

Transcript

Frisättningen av extracellulära fällor av neutrofiler och andra immunceller är viktigt med medfödd immunitet men också starkt kopplat till inflammatoriska patologier. Mycket lite är känt om denna process i makrofager även om dessa celler spelar en avgörande roll i inflammatoriska svar. Detta protokoll ger en primär mänskliga in vitro-modell av makrofager extracellulära fälla eller mast release.

Det ger en modell för oss att studera en potentiell fysiologisk tillväxt av denna struktur in vivo. Den största fördelen med denna teknik är att cellerna från detta protokoll är primära celler isolerade från mänskliga buffy coat preparat. Det finns ingen priming steg som krävs för att differentiera monocyten i makrofager, vilket är kontrast med andra monocyter cellinje såsom THP-1 cellinje.

Detta protokoll är lätt anpassas till andra immunceller inklusive isolerade neutrofil och microglia. Extracellulär fälla som produceras av makrofager är mycket bräckliga, så bryr måste tas mellan steg för att bevara integriteten hos de färgade fällor. Under sterila förhållanden, förbereda M1 priming medium genom att till den kompletta RPMI-1640 kulturmedier, interferon gamma till koncentrationen av 20 nanogram per milliliter och lipopolysackarid till koncentrationen av ett mikrogram per milliliter.

Förbered M2 priming media genom att lägga till interleukin 4 till den kompletta RPMI-1640 kultur media till koncentrationen av 20 nanogram per milliliter. Under sterila förhållanden aspirerar man från de sådde och odlade vävnadskulturplattans brunnar som innehåller HMDM. Tillsätt försiktigt i varje brunn, en milliliter steril PBS förvörd till 37 grader Celsius.

Ta bort PBS-bufferten och tvätta ytterligare två gånger. Tillsätt en milliliter av antingen M1 eller M2 priming media till varje brunn som innehåller HMDM. Inkubera cellerna i 48 timmar vid 37 grader Celsius i närvaro av 5%koldioxid i en cellinkubator.

Under sterila förhållanden, förbereda den kultur media som innehåller olika stimulatorer av MET release till den kompletta RPMI-1640 media. För experiment med hypokloös syra stimulering, förbereda 200 mikromolar hypokloös syra i en Falcon rör med HBSS som har förvämrats till 37 grader Celsius. Efter polarisationsbehandlingen aspirerar du cellmedierna från varje brunn och tvättar försiktigt cellerna tre gånger med en milliliter-alikvoter av antingen steril PBS för PMA, TNF alfa och interleukin 8 stimulering eller HBSS för hypokloös syrastimulering.

När du har tagit bort PBS i det slutliga tvättsteget, tillsätt en milliliter av kompletta medier som innehåller PMA, TNF alfa eller interleukin 8. Inkubera cellerna i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i en cellinkubator i sex timmar för TNF alfastimulering och 24 timmar för PMA eller interleukin 8 stimulering. För experiment med hypokloös syra, efter att ha tagit bort HBSS i det slutliga tvättsteget, tillsätt en milliliter nyberedda hypokloössyra.

Sedan inkubera cellerna i 15 minuter vid 37 grader Celsius i närvaro av 5%koldioxid i en cellinkubator. Därefter aspirerar försiktigt cellernas supernatant och tvättar cellerna tre gånger med en milliliter alikvoter av HBSS. När HBSS har tagits ut från det sista tvättsteget, tillsätt en milliliter komplett RPMI-1640-odlingsmedia.

Sedan inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 grader Celsius i närvaro av 5%koldioxid i en cell inkubator. Förbered SYTOX grönt färgämne i HBSS vid en koncentration av 40 mikromolar. Direkt tillsätt 25 mikroliter av färgämnet till varje brunn som innehåller HMDM.

Inkubera celler i rumstemperatur i 5 minuter i mörker. Placera sedan HMDM i vävnadskultur brunnar på mikroskopet skede av en inverterad fluorescerande mikroskop för avbildning. Slå på en bredspektrum fluorescerande ljuskälla, ljuskälla på ljusa fält och inverterat mikroskop installerat med en högupplöst digitalkamera i färg.

Rotera filterhjulet till nummer två-positionen för grön fluorescens med excitation vid 504 nanometer och dimension vid 523 nanometer. Använda 5X objektivet, fokusera bilden med grov fokus sedan den fina fokus knoppar på mikroskopet tills bilden visas skarpa, tydliga och fokuserade. Växla mikroskopet till Kameraläge.

Starta den tillhörande programvaran. Klicka på knappen Spela upp för att förhandsgranska bilden och justera den fina fokusratten på mikroskopet tills bilden visas skarp, tydlig och fokuserad i fönstret för förhandsgranskning av programvara. Klicka på capture-knappen.

Klicka på Arkiv inom programvaran. Spara som den nödvändiga bildfiltypen. På mikroskopet roterar du filterhjulet till nummer fem-positionen för avbildning med ljusa fält och upprepar infångningsprocedurerna för att erhålla motsvarande ljusfältsbild.

Ljusa fältbilder som visar de morfologiska förändringarna av HMDM som svar på stimuli visas här. M1-polariserade makrofager från experiment med HMDM utsätts för interferon gamma och lipopolysaccharide visade en långsträckt och spindel-liknande cell form. Som jämförelse var morfologi m2-polariserade makrofager efter exponering av HMDM till interleukin 4 för 48 timmar vanligtvis runda och platta.

Förmågan hos differentierade HMDM fenotyper att släppa METs visualiserades av levande-cell fluorescens imaging med SYTOX grön. Kontrollen erhålls från varje HMDM fenotyp inkuberas i 24 timmar i avsaknad av eventuella pro-inflammatoriska stimuli visade mycket begränsad grön färgning. Positiv färgning för METs, som visas som gröna streck, uppnåddes med exponering av M1-HMDM för hypokloös syra, PMA, interleukin 8 eller TNF alfa.

Förekomsten av vissa gröna färgning uppenbara i cellerna återspeglar förlust av membran integritet som kan resultera från celldöd som är oberoende av extracellulära fällan release. Experimenten som utfördes med M2-HMDMs exponerade för interleukin 4 visade ingen frisättning av DNA från cellerna, vilket indikeras av frånvaron av strängarna eller streck av extracellulärt DNA. Det fanns dock några cellulära upptag av gröna fluorescerande färgämne med hypokloous syra och TNF alfa.

Det är viktigt att undvika det direkta starka ljuset som kan överexponera färgningen innan avbildning. Extracellulära DNA kan kvantifieras genom qPCR analys på nukleära och mitokondriellt DNA som finns i cellen supernatant. Ytterligare karakterisering av mast struktur och dess roller i kronisk inflammation med hjälp av HMDM kan vara mer kliniskt relevant i jämförelse med andra förevigade celllinje makrofager butiker.

X

Simple Hit Counter