Medicine
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Undersøke intestinal barriere sammenbrudd i levende organoider
Chapters
Summary March 26th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi en teknikk for å kvantifisere barriereintegriteten til små tarmorganoider. Det faktum at metoden er basert på levende organoider muliggjør sekvensiell undersøkelse av ulike barriere integritet modulerende stoffer eller kombinasjoner derav på en tidsbestemt måte.
Transcript
Med sikte på å undersøke intestinal barriereintegritet utviklet vi en metode for å måle tarmbarriereintegriteten i mus små tarmorganoider. I motsetning refererer vi til brukt monolayer cellekultur, vår analyse er basert på tredimensjonale små tarmorganoider. Tilpasning av en todimensjonal analyse til vår modell var avgjørende for det praktiske.
Analysen er basert på organoider dyrket in vitro og dens anvendelse vil bidra til å definere induktorer og hemmere av tarmbarriereintegriteten. Reguleringen av tette koblingsproteiner er et viktig trekk ved alle epitelceller. Vår analyse muliggjør funksjon og analyse av epitelbarriereintegritet.
For å måle barriereintegriteten til organoider isolert fra mus tarmvev, først precoat alle sentrifugering rør som skal brukes til lagring av organoider under plating prosessen med nok 0,1% BSA i PBS for å dekke alle plastoverflater. Fjern straks BSA-løsningen og legg rørene på is. Deretter tiner cellematriseløsningen og organoidkulturmediet på is og fjerner forsiktig kulturmediet fra hver brønn av en 48 godt organoid kulturplate.
Vask hver brønn med en milliliter kald PBS før kraftig pipettering for å oppløse cellematrisene. Når relativt homogene cellesuspensjoner er oppnådd, vask organoidene med fersk PBS to ganger ved sentrifugering og gjenoppuss hver organoidkultur i 40 mikroliter kaldt medium. Dissosier de store organoide strukturene gjennom en 10 mikroliter pipettespiss fem ganger for å samle strukturer med en 40 til 60 mikrometerstørrelse og bland hver organoid suspensjon med 40 mikroliter nylaget cellematriseløsning.
Tilsett hver organoid cellematriseløsningsoppheng i midten av individuelle brønner av en åtte godt kamret dekkslipp og plasser lysbildet på en ispakke i fem minutter. På slutten av inkubasjonen plasserer du lysbildet ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 20 minutter for å muliggjøre polymerisering av organoidcellematrisestrukturen før du legger til 150 mikroliter organoidkulturmedium til hver brønn i en 24-timers inkubasjon i cellekulturinkubatoren. På slutten av inkubasjonen, behandle de positive kontrollbrønnene med 10 nanogram per milliliter rekombinant murin interferon gamma i 48 timer.
For å utføre en permeabilitetsanalyse, overfør det kamret dekkslipp til 37 grader Celsius varmet inkubasjonskammeret til et omvendt konfokalmikroskop og sett karbondioksidet i kammeret til 5% Lås dekkslipset tett på mikroskopstadiet og juster bildeinnstillingene til mikroskopet for å visualisere organoidene i en brønn av kammeret. Deretter legger du til tre mikroliter med nyoppberedte 100 millimolar Lucifer gul i 150 mikroliter medium til en brønn i en time inkubasjon i mikroskopkammeret. På slutten av inkubasjonen, juster fokuset for å visualisere lumen av referanseorganoiden og definere den nødvendige laserenergien for Lucifer gul eksitasjon og instrumentets respektive deteksjonsfølsomhet for å bilde Lucifer gult signal på 30 til 40% av det tilgjengelige dynamiske området til instrumentet.
Alternativt kan signalintensiteten endres ved å endre eksponeringstiden. For å finne posisjonene til ca 10 organoider med en sfærisk struktur nær dekkslepoverflaten per brønn ved differensial interferens kontrast levende bildebehandling, fange organoider med sammenlignbare diametre og fokusere på den sentrale delen av organoider for å bilde lumen. Registrer differensialinterferenskontrasten og Lucifer gul fluorescens av hver posisjon for å dokumentere formen og autofluorescensen til hvert organoid.
Når alle organoider har blitt avbildet, legg til 150 mikroliter med medium, inkludert Lucifer gul, til Lucifer gule behandlingsbrønner og bilde alle brønnene hvert femte minutt i 70 minutter. På slutten av bildeøkten legger du til fire mikroliter med nyberedte EGTA til 100 mikroliter medium. Tilsett fortynnet EGTA til de aktuelle brønnene.
Deretter registrerer du fluorescensen av organoidene i hver brønn hvert femte minutt i 30 minutter. Sørg for å praktisere håndtering og kultur eller organoider på forhånd som cellulær levedyktighet og integritet er en forutsetning for suksessen til analysen. I dette representative eksperimentet, etter 70 minutters behandling med Lucifer gul intraluminal Lucifer gul fluorescens var bare synlig i organoider fra vill type dyr behandlet med interferon gamma.
Verken uforstimulerte kontroller eller organoider avledet fra interferon gamma reseptor-2 knockout dyr viste intraluminal Lucifer gul fluorescens på slutten av behandlingsperioden. Tilsetning av EGTA forårsaket en uspesifisk nedbryting av tarmbarriereintegriteten ved å sequestering tette koblingskofaktorer, noe som resulterte i Lucifer gul take-up og uttrykk i alle organoider uavhengig av opprinnelse eller behandlingsforhold. De relative intensitetsverdiene for Lucifer gul fluorescensnivå innenfor organoidlumen og utenfor hver organoid kan også kvantifiseres.
Pass på å velge organoider med en sammenlignbar størrelse rundt konfigurasjon og for å velge den angitte aksen slik at du kan forestille deg organoidens sentrale lumen. I tillegg til å bruke stoffer som induserer tarmbarrieren sammenbrudd, kan vi også undersøke strategier for hemming av tarmbarriereødeleggelse. Siden denne metodikken er basert på primære celler fra et enkelt dyr, kan den brukes til mange analyser, noe som reduserer antall dyr som kreves for hvert eksperiment.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
