Medicine
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Undersøgelse intestinal barriere opdeling i levende organoider
Summary March 26th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi en teknik til at kvantificere barriereintegriteten af små tarmorganoider. Det forhold, at metoden er baseret på levende organoider, gør det muligt at foretage sekventiel undersøgelse af forskellige barriereintegritetsmodulerende stoffer eller kombinationer heraf på en tidsløst måde.
Transcript
Med det formål at undersøge tarmbarrierens integritet udviklede vi en metode til at måle tarmbarrierens integritet i museminele tarmorganoider. I modsætning hertil henviser vi til brugt monolag cellekultur, vores analyse er baseret på tredimensionelle små tarm organoider. Tilpasning af en todimensionel analyse til vores model var afgørende for dens praktiske.
Analysen er baseret på organoider dyrket in vitro og dens anvendelse vil bidrage til at definere inducere og hæmmere af tarmbarriere integritet. Reguleringen af stramme krydsproteiner er et vigtigt element i alle epitelceller. Vores analyse muliggør funktion og analyse af epitelbarriere integritet.
For at måle barriereintegriteten for organoider, der er isoleret fra museintestinale væv, skal du først precoate alle de centrifugeringsrør, der skal anvendes til opbevaring af organoiderne under pletteringsprocessen med nok 0,1% BSA i PBS til at dække alle plastoverfladerne. Fjern straks BSA-opløsningen, og læg rørene på is. Dernæst tø celle matrix løsning og organoid kultur medium på is og forsigtigt fjerne kultur medium fra hver brønd af en 48 godt organoid kultur plade.
Vask hver brønd med en milliliter kold PBS før kraftigt pipettering at opløse cellen matricer. Når der er opnået relativt homogene cellesuspensioner, vaskes organoiderne med frisk PBS to gange ved centrifugering, og hver organoidkultur skal opspærres igen i 40 mikroliter koldt medium. Dissocier de store organoid strukturer gennem en 10 mikroliter pipette spids fem gange for at indsamle strukturer med en 40 til 60 mikrometer størrelse og bland hver organoid suspension med 40 mikroliter frisklavet celle matrix løsning.
Tilføj hver organoid celle matrix løsning suspension i midten af de enkelte brønde i en otte godt chambered coverslip og placere dias på en ispose i fem minutter. Ved slutningen af inkubationen skal du placere diaset ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 20 minutter for at muliggøre polymerisering af organoid celle matrix struktur, før du tilføjer 150 mikroliter af organoid kultur medium til hver brønd for en 24 timers inkubation i cellen kultur inkubator. Ved slutningen af inkubationen behandles de positive kontrolblys med 10 nanogram pr. milliliter rekombinant murin interferon gamma i 48 timer.
For at udføre en permeabilitetsanalyse skal du overføre dækslet til 37 grader Celsius-opvarmet inkubationskammer i et omvendt konfokal mikroskop og indstille kammerets kuldioxid til 5%Lås dækslet stramt på mikroskopfasen og juster mikroskopets billeddannelsesindstillinger for at visualisere organoiderne i en brønd af kammeret. Derefter tilsættes tre mikroliter frisklavet 100 millimolar Lucifer gul i 150 mikroliter af medium til en brønd i en time inkubation i mikroskopkammeret. Ved slutningen af inkubationen justeres fokus for at visualisere lumen af referenceorganoidet og definere den nødvendige laserenergi til Lucifers gule ophidselse og instrumentets respektive detektionsfølsomhed for at afbilde Lucifers gule signal ved 30 til 40 % af instrumentets tilgængelige dynamiske område.
Alternativt kan signalintensiteten ændres ved at ændre eksponeringstiden. For at finde placeringen af omkring 10 organoids med en sfærisk struktur tæt på coverslip overflade per godt ved differentialinterferens kontrast levende billeddannelse, fange organoider med sammenlignelige diametre og fokusere på den centrale skive af organoids at billedet lumen. Optag differentialeferens kontrast og Lucifer gule fluorescens af hver position til at dokumentere formen og auto-fluorescens af hver organoid.
Når alle organoider er blevet afbildet, tilsættes 150 mikroliter af medium, herunder Lucifer gul, til Lucifer gule behandling brønde og billede alle brønde hvert femte minut i 70 minutter. I slutningen af billedbehandlingssessionen skal du tilføje fire mikroliter frisklavet EGTA til 100 mikroliter af medium. Tilsæt den fortyndede EGTA til de relevante brønde.
Derefter registrere fluorescens af organoids i hver brønd hvert femte minut i 30 minutter. Sørg for at praktisere håndtering og kultur eller organoids på forhånd som cellulære levedygtighed og integritet er en forudsætning for succes i analysen. I dette repræsentative eksperiment var gul fluorescens kun synlig i organoider fra vilde dyr, der blev behandlet med interferon gamma, efter 70 minutters behandling med Lucifers gule intraluminale Lucifer-gule fluorescens.
Hverken ustimulerede kontroller eller organoider afledt af interferon gamma receptor-2 knockout dyr viste intraluminal Lucifer gul fluorescens ved afslutningen af behandlingsperioden. Tilføjelsen af EGTA forårsagede en uspecifik nedbrydning af tarmbarrierens integritet ved at afsone stramme kollidsfaktorer, hvilket resulterede i Lucifers gule brug og udtryk i alle organoider uanset oprindelses- eller behandlingsvilkår. De relative intensitetsværdier for Lucifers gule fluorescensniveau inden for organoidlummen og ydersiden af hvert organoid kan også kvantificeres.
Sørg for at vælge organoider med en sammenlignelig størrelse omkring konfiguration og for at vælge den indstillede akse, så du kan forestille dig den centrale lumen af organoid. Ud over at bruge stoffer, der fremkalder nedbrydning af tarmbarrieren, kan vi også undersøge strategier for hæmning af ødelæggelse af tarmbarrierer. Da denne metode er baseret på primærceller fra et enkelt dyr, kan den anvendes til mange analyser, hvilket reducerer antallet af dyr, der kræves til hvert forsøg.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE