Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Apoptose induksjon og deteksjon i en primær kultur av Sea agurk intestinal celler
Chapters
Summary January 21st, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen gir en lett-å-håndtere metode for å kulturen i tarm celler fra havet agurk Apostichopus japonicus og er kompatibel med en rekke allment tilgjengelige vevsprøver fra Marine organismer, inkludert Echinodermata, Mollusca, og krepsdyr.
Transcript
Protokollen gir en lett-å-håndtere og allment kompatibel primær celle kultur metode for marine virvelløse dyr. Denne teknikken gir forskere en måte å dyrke de marine virvelløse cellene i relativt lang tid. En kultur av celler bør gis med konsistent genetisk bakgrunn for ulike ytterligere biologiske eksperimentelle anvendelser i marinbiologiforskning.
Til den nye forskningen på dette feltet mener vi at den angitte forenklede protokollen bør være det gode valget å trene. Etter bedøvelse, dissekere og samle fremre tarmene, og del deretter vevsprøvene vertikalt og fjern det indre innholdet. Vask vevsprøvene i PBS to ganger og desinfiser dem ved nedsenking i en 75% etanolløsning i ikke lenger enn to sekunder.
Vask deretter vevsprøvene i PBS tre ganger for å fjerne etanol, og overfør ca 100 milligram vevsprøve til et to milliliter sterilt mikro sentrifugerør. Tilsett 1,5 milliliter forhåndsoptimalisert kulturmedium til sjøpølse tarmvevsblokken og hakke blokken med sterilisert kirurgisk saks til løsningen er overskyet. Legg til 400 mikroliter på 0,25% trypsin.
Bland løsningen ved inversjon og inkuber den i fem minutter ved romtemperatur. Deretter filtrerer du løsningen ved hjelp av en 100 mikron cellesil og samler filtratet i et nytt sterilt to milliliter mikro sentrifugerør. For valgfri forenklet protokoll kan vevsblokker kuttet i kultiverte medier overføres direkte til retter og deretter inkuberes.
Sentrifuger røret ved 1700xG i tre minutter, kast supernatanten, og suspender pelleten i kulturmedium med antibiotika, og vask det med kulturmedium to ganger. Forhåndsinnsett inkubatoren for cellekultur, og kjør den på forhånd i minst 24 timer med temperaturen på 18 grader Celsius og mettet fuktighet. Deretter re-suspendere cellene ved hjelp av 200 mikroliter av indikert medium, og overføre dem til fire centimeter retter.
Kultur cellene i en inkubator. Etter seks timer, ta dem ut av inkubatoren og legg til to milliliter indikert medium til celle culturing retter. Hver 12.
Etter fem til syv dager begynner cellene å dele seg. Reduser de negative effektene av antibiotika ved å redusere konsentrasjonen av indikerte antibiotika, penicillin, streptomycin og gentamicin i kulturmediet til det halve. Hver to til tre dager erstatter du cellekulturmediet.
Når den primære celletettheten når 60% oppførsel celle passaging. Vask først de kultiverte cellene to ganger ved hjelp av PBS ved romtemperatur. Tilsett 200 mikroliter på 0,25% trypsinløsning til hver tallerken, og rør oppvasken manuelt, slik at hele bunnen er dekket.
Kast trypsinløsningen, og inkuber cellene i fem minutter ved romtemperatur. Vask cellene med en milliliter frisk kultur medium ved å pipettere og re-suspendere cellene. Overfør 0,5 milliliter cellesuspensjon til en ny tallerken.
Tilsett 1,5 milliliter friskt medium, og inkuber cellene ved 18 grader Celsius. Etter 12 timer, endre mediet, og observere cellene under et mikroskop for å evaluere forholdene. Forbered tre eksperimentelle grupper, inkludert en kontroll, og to grupper av løsninger, med en mikromos og 100 mikromos deximetazon.
Etter inkubasjon med eller uten deximethazon i null, 24 eller 48 timer, vask cellene tre ganger med PBS. Etter å ha slått av lyset, tilsett 300 mikroliter hoechst 33258 løsning per brønn til en 12 brønnplate, og forsiktig røre platen for å dekke alle celler, noe som sikrer deres farging. Inkuber ved 18 grader Celsius i 30 minutter.
Fjern deretter den hoechst fargeløsningen og fest cellene ved å legge til 300 mikroliter på fire prosent paraformaldehydløsning i PBS til hver brønn. Rør forsiktig i 15 minutter. Deretter vasker du de faste cellene tre ganger i PBS.
Hold PBS etter siste vask for å holde cellene dekket. Slå på fluorescerende mikroskopmaskinvare, inkludert kvikksølvlampekraften, lysstoffrørskraften og PC-en. Logg inn på operativsystemkontoen, start programvaren og kontroller konfigurasjonen. Plasser den tilberedte platen på mikroskopstadiet.
Plasser prøven over objektivobjektivet ved hjelp av scenekontrolleren. Finn cellene av interesse under det lette mikroskopet. Bytt til fluorescerende mikroskopi og juster parametrene for eksitasjon og utslipp til henholdsvis ca. 352 og 461 nanometer for nuklei DNA-observasjon.
Ta bildene. I denne studien ble primær tarmcellekultur av sjøpølse etablert og passasjer. Runde celler i ulike stadier av kultering er vist her.
Her er celler festet til bunnen av retter på den tredje dagen, etter å ha blitt sådd. Her er cellespredning på den syvende dagen. Her er celler festet til bunnen av oppvasken etter passaging.
Og celler som mistet aktivitet og døde etter 10 passasjer. EDU-analysene gir direkte bevis for å avsløre den proliferative aktiviteten til disse runde cellene i senere stadier. Stimuleringen med en mikromolar deximethazon økte apoptotisk cellehastighet raskest, sammenlignet med kontrollen og 100 mikromolar deximethazone stimulering.
De kultiverte cellene ble behandlet med deximethazon i ulike tidsperioder, etterfulgt av hoechst 33258 farging for apoptotisk celledeteksjon. Cellebehandlinger før inkubering er avgjørende for langsiktig kontroll. Det er en påminnelse om å prøve den valgfrie forenklede protokollen når cellen ikke vokser godt.
Paraformaldehyd er moderat giftig ved hudkontakt eller innånding, og det er dokumentert som et sannsynligvis humant kreftfremkallende.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
