Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Productie van near-infrared sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform
Summary October 20th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit artikel beschrijft de protocollen die worden gebruikt om een nieuw vaccin levering platform te produceren, "polybubbles," om vertraagde burst release mogelijk te maken. Polyesters, waaronder poly(melk-co-glycolzuur) en polycaprolactone werden gebruikt om de polybubbles te vormen en kleine moleculen en antigeen werden gebruikt als lading.
Transcript
Dit protocol kan helpen de stabiliteit van de lading, die zowel kleine moleculen als eiwitten kan zijn, te behouden door het gebruik van de polybubble, die op zijn beurt de koolstofinteracties met het oplosmiddel kan verminderen. Deze nieuwe techniek kan worden gebruikt om de dekking van vaccins in de ontwikkelingslanden te verbeteren, omdat vaccinfunctionaliteiten vaak in het gedrang kunnen komen als gevolg van inefficiënte transport- en opslagfaciliteiten. Om de polybubbles te fabriceren, gebruik dan eerst een één milliliter transferpipet om 800 microliter van 10%CMC toe te voegen aan een 0,92 milliliter glazen flacon.
Om PCLTA te synthetiseren, meng 1.000 gram per milliliter van 14 kilodalton PCL in 200 microliters van DCM. Om PLGADA te synthetiseren, meng 1.000 gram per milliliter van vijf kilodalton PLGADA tot 200 microliter chloroform. Meng fotoinitiator met het polymeermengsel van belang bij een verhouding van 0,005 tot 1 en laad 200 microliters van de resulterende oplossing in een één milliliter glasspuit gemonteerd op een spuitpomp die is aangesloten op een roestvrijstalen buis met een binnendiameter van 0,016 inch.
Met behulp van een micromotor om de voorwaartse en achterwaartse beweging van de polymeerbuis te regelen, injecteer het polymeer in de 10%CMC in de glazen flacon om de polybellen te vormen en genees de polybellen onder ultraviolet licht op een golflengte van 254 nanometer gedurende 60 seconden bij twee watt per vierkante centimeter, en bevries vervolgens de polybellen in vloeibare stikstof gedurende 30 seconden en lyofiel de dragers 's nachts op 0,01 millibar vacuüm in min 85 graden Celsius. Voor het centreren van de lading van belang binnen een polybubble, meng de lading met 5%CMC in een rotator 's nachts om de viscositeit van de lading te verhogen voordat handmatig injecteren twee microliters van het vrachtmengsel in de polybubble. Wanneer alle van de lading is geïnjecteerd, re-cure, flash bevriezen, en lyophilize de geïnjecteerde polybubble zoals net aangetoond.
De volgende ochtend, gebruik tangen om de polybubble te scheiden van de gedroogde CMC en was de polybubble met gedeïoniseerd water om eventuele resterende CMC te verwijderen. Snijd vervolgens de polybubble doormidden en beeld de helften door confocale microscopie om ervoor te zorgen dat de lading gecentreerd is. Voor kleine molecuul lading release, incubeer de polybubbles met gecentreerde acriflavine in 400 microliters van PBS bij 37 graden Celsius voor de juiste incubatielengte.
Verzamel op elk experimenteel tijdstip het supernatant en voeg 400 microliter verse PBS toe aan de flacon. Gebruik vervolgens een plaatlezer om de fluorescentieintensiteit van het verzamelde supernatant te kwantificeren. Voor nabij-infrarood activering, meng de polymeeroplossing met hydrofobe gouden nanostaven op een één tot negen verhouding en voeg foto initiator op een 0.005 tot 1 verhouding.
Injecteer het resulterende mengsel in een 0,92 milliliter glazen flacon met 800 microliter van 10%CMC en genees de polybubbles onder ultraviolet licht zoals aangetoond. Na het bevriezen van de flits en lyophilisatie zoals aangetoond, was de polybellen met gedeïoniseerd water en incubeer de dragers in 400 microliter van PBS bij 37 graden Celsius voor de aangewezen incubatieperiode. Aan het einde van de incubatie, het verkrijgen van een vooruitstrevend infrarood beeld van de polybubble voor en na het activeren van de polybellen met een 801 nanometer nabij-infrarood laser op acht ampère gedurende vijf minuten gedurende vijf minuten gedurende vier weken gedurende vier weken voor PLGADA polybubbles en 14 weken voor PCL-PCLTA polybubbles.
Verzamel op elk experimenteel tijdstip het supernatant en voeg 400 microliter verse PBS toe aan de flacon. Bereken vervolgens de temperatuurverschillen tussen de polybubbles voor en na laseractivering op basis van de temperatuurwaarden van de toekomstgerichte infraroodbeelden. De toevoeging van 10%CMC-gebaseerde waterige oplossing resulteert in een complete polybubble suspensie voor een succesvol onderhoud van de polybubble sfericiteit.
Ladinginjectie in de polybubble bij afwezigheid van CMC resulteert in lekkage en een daaruit voortvloeiend gebrek aan ladingretentie in de polybubble. Om deze lekkage aan te pakken, kan de viscositeit van de PCLTA worden verhoogd met behulp van kaliumcarbonaat geïsoleerd na het beëindigen van polycaprolactone met triacrylaat en de viscositeit van de lading kan worden verhoogd door de lading te mengen met 5%CMC. De viscositeit van de PLGADA polybubbles is voldoende om de centrering van de lading te vergemakkelijken en vereist geen modulatie via kaliumcarbonaat.
Merk op dat er geen statistisch significant verschil in de bindingsefficiëntie van het antilichaam wordt waargenomen na het mengen van HIV-gp120/41-antigeen met en zonder trehalose vóór polybubbelinjectie. Vertraagde burst releases worden waargenomen in PLGADA polybubbles met acriflavine in het midden op dag 19 voor polybubbles geïncubeerd op 37 graden Celsius en op dag vijf voor polybubbles geïncubeerd op 50 graden Celsius. Bovendien kunnen PLGADA polybubbles en PCL en PCLTA polybubbles met gouden nanostaven meerdere keren met succes worden laser-geactiveerd.
Let er bij het vormen van de polybellen op dat de reagentia tegen het licht worden beschermd en dat u de oplossingen ook onmiddellijk gebruikt. Na de ontwikkeling van deze technologie wilden we ook het automatiseren van dit proces onderzoeken om de polybubbleproductie op te schalen.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
