Journal
/
/
Identifikation af Transskription Factor Regulators ved hjælp af Medium-Throughput Screening af Arrayed Biblioteker og en Dual-Luciferase-baserede Reporter
JoVE Journal
Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Cancer Research
Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identifikation af Transskription Factor Regulators ved hjælp af Medium-Throughput Screening af Arrayed Biblioteker og en Dual-Luciferase-baserede Reporter

6,565 Views

11:32 min

March 27, 2020

DOI:

11:32 min
March 27, 2020

12 Views
,

Transcript

Automatically generated

Denne protokol kan bruges til at screene arrayed lentiviral eller retroviral analyse biblioteker til at identificere nye regulatorer af transskription faktorer i kræftceller. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at det er hurtigt, medium gennemløb, og billig, og at det bruger udstyr og reagenser almindeligt tilgængelige for de fleste efterforskere. For at udvide og rense hver lentiviral vektor i biblioteket, først tilføje 1,3 milliliter Luria bouillon suppleret med 100 mikrogram pr milliliter ampicillin til hver brønd af en 96-godt dyb brønd plade.

Inokuler hver brønd med to mikroliter af glycerol lager for en overnatning inkubation ved 37 grader Celsius og 225 omdrejninger i minuttet. Den næste dag, overføre hver bakterie kultur i individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør til centrifugering. Rens hver vektor med en passende bakteriel miniprep kit i henhold til producentens anvisninger.

For hver vektor i det forberedte bibliotek, frø en brønd af en 24-brønd plade med en gange 10 til den femte 293FT celler og inkubere cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 24 timer. For at forberede en transfektionsblanding, som vil blive oprettet for hver vektor i biblioteket, skal du først elute hver lentiviral vektor til en endelig koncentration på 50 nanogram pr. mikroliter med nukleasefrit vand. Overfør fem mikroliter af hver fortynding til individuelle brønde af en 96-brønd PCR plade.

Lav en transfektion super mix ved at blande 1,25 mikroliter gange x transfektion reagens en med 23,75 mikroliters gange x af forvarmt transfektion buffer. Inkuber transfektion super mix ved stuetemperatur i fem minutter. Derefter tilsættes 125 nanogram gange x psPAX2 og 125 nanogram gange x VSVG til super mix med blid pipettering.

Umiddelbart aliquot super mix i hvert rør af en PCR strimmel og bruge en multikanal pipette til at overføre 25 mikroliter af blandingen i hver brønd af fortyndet viral vektor. Efter en 20 minutters inkubation ved stuetemperatur, bruge en multikanal pipette til at overføre 30 mikroliter af hver transfektion blanding fra hver brønd i en tilsvarende brønd på 293FT celler i den tidligere forberedte 24-brønd plade. Inkuber cellerne i 24 timer, før mediet udskiftes i hver brønd med 500 mikroliter af frisk komplet vækstmedium til endnu en 24-timers inkubation i cellekulturkubvøsen.

Den næste dag, bruge en multichannel pipette til at indsamle den virale supernatant fra hver brønd og aliquot 220 mikroliter af hver supernatant i to brønde i en ny 96-brønd plade til at generere en arrayed viral supernatant plade. For at forberede A375 celler til infektion, frø en gange 10 til den femte celler i en 24-brønd plade i 0,5 milliliter komplet vækstmedium pr brønd for hver viral vektor i biblioteket. Medtag en ekstra brønd, der ikke vil blive smittet til at tjene som en kontrol for valg af lægemidler.

Efter en 24-timers inkubation i cellekulturinkubatoren optø den frosne arrayed lentiviral supernatant sat til stuetemperatur, før vækstmediet udskiftes fra hver brønd af den forberedte cellekulturplade med 200 mikroliter vækstmedium suppleret med 20 mikrogram pr. milliliter polybren. Ved hjælp af en multikanalpipette, overfør 200 mikroliter viral supernatant fra hver 96 brønd til hver brønd af 24-brøndpladen. Returner cellerne til cellekulturskuvøsen i 24 til 48 timer.

Ved slutningen af inkubationen udskiftes mediet i hver brønd med 500 mikroliter vækstmedium suppleret med puromycin, og cellerne returneres til cellekulturkubvøsen i yderligere 48 timer. Efter 48-timers puromycin udvælgelse, sortere cellerne i tre eller fire grupper, således at alle brønde i en enkelt gruppe har en lignende celletæthed og tilføje 200 mikroliter trypsin-EDTA til en repræsentativ brønd fra hver gruppe for en fem-minutters inkubation ved 37 grader Celsius. Når cellerne har løsrevet, neutralisere trypsin med 400 mikroliter af vækstmedium suppleret med puromycin og tælle antallet af celler fra hver trypsinized godt.

Fortynde hver celle suspension til en to gange 10 til den femte celler pr milliliter koncentration med vækstmedium suppleret med puromycin og frø 500 mikroliter af celler fra hver godt i samme godt position i en ny 24-brønd plade. Efter brug af tællingerne fra hver repræsentant godt til at estimere celletallet i hver resterende brønd i hver gruppe, tilsættes det relevante volumen af trypsin-EDTA til hver brønd for at opnå en gange 10 til den sjette celle pr. milliliterkoncentration. Under trypsinisering, bruge en multichannel pipette til at tilføje 400 mikroliter af vækstmedium suppleret med puromycin til de relevante tilsvarende brønde i den nye 24-brønd plade.

Når cellerne er afmonteret, skal du forsigtigt blande indholdet af hver brønd og overføre 100 mikroliter af hver cellesuspension til den passende tilsvarende brønd i den nye 24-brøndplade. Vend derefter cellerne tilbage til cellekulturskuvøsen i 24 timer. At transfect cellerne med dobbelt-luciferase reporter konstruktioner, forberede transfection fortynding blandingen som angivet i tabellen.

For at forberede reporterfortyndingsblandingen blandes mængderne af hvert reagens ganget med det samlede antal transfektioner plus flere ekstra volumener. Dernæst blandes transfektionfortyndingsblandingen med reporterfortyndingsblandingen og den resulterende opløsning ved stuetemperatur i 15 minutter for at fremstille transfection-blandingen. Under inkubationen skylles hver brønd af cellekulturpladen med 250 mikroliter PBS og tilsættes 447 mikroliter frisk komplet vækstmedium til hver brønd.

Brug derefter en multikanalpipette til at distribuere 53 mikroliter transfektionsblanding til hver brønd af cellekulturpladen. Placer pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 24 timer. Til måling af luciferaseaktiviteten fortyndes 5X passiv lysisbuffer fra luciferase-aktivitetssættet ved en en-til-fem fortynding med deioniseret vand og tø de nødvendige mængder reagens A og reagens B-buffer fra sættet.

Når reagenserne er klar, udskiftes supernatanten i hver brønd med 75 mikroliter passiv lysisbuffer, og pladen inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur med lejlighedsvis omrystning. Under inkubationen fortyndes 50X reagens B-substratet fra sættet til en en-til-50 koncentration med optøet reagens B-buffer. Ved slutningen af inkubationen tilsættes 30 mikroliter passiv lysisbuffer til fire blanke kontrolblyde og overføres 30 mikroliter lysat fra hver brønd i dobbeltblys af en 96-godt flad bundhvid analyseplade.

Når alt lysatet er blevet belagt, skal du bruge en multikanalpipette til at tilføje 50 mikroliter reagens A til hver brønd og læse firefly luciferase-signalet med en pladelæser. Brug derefter en multikanalpipette til at tilføje 50 mikroliter reagens B til hver brønd og læs Renilla luciferase signalet med en pladelæser. Som forventet, YAP2SA øger firefly luciferase aktivitet, men ikke Renilla luciferase aktivitet i forhold til kontrol vektor.

I modsætning hertil øger YAP2SA S94A ikke brandfly luciferase aktivitet. Det er vigtigt, at YAP2SA ikke ændrer aktiviteten af en minimal promotor konstruktion, der mangler MCAT TEAD bindende elementer. I celler transficeret med YAP-TAZ-TEAD reporter konstruere, tandem YAP og TAZ korte hårnåle betydeligt reduceret firefly luciferase niveauer, men kontrollen kort hårnål ikke-målretning kontrol ikke.

I modsætning hertil, i celler transficeret med den minimale reporter konstruere, YAP-TAZ korte hårnål RNA ændrer ikke væsentligt firefly luciferase niveauer. Den Renilla signal i hver brønd er heller ikke væsentligt ændret ved den korte hårnål ikke-målretning kontrol eller YAP-TAZ kort hårnål RNA. Som forventet reducerer korte hårnåle RNAs rettet mod YAP og TAZ, SARC eller PI3 kinase sig YAP-TAZ-TEAD-aktiviteten betydeligt.

Korte hårnåle RNAs rettet mod ATM, CDH1, CSK, ERBB2 og gelsolin hver øget normaliseret firefly luciferase niveauer i overensstemmelse med offentliggjorte undersøgelser, der viser, at disse proteiner var YAP og / eller TAZ. På trods af etablerede roller for ATR, CCNE2 og ERBB4 i andre celletyper, ændrer korte hårnåle RNAs rettet mod disse gener ikke signifikant normaliserede firefly luciferase niveauer i A375 celler. Efter dette skærmbillede bør identificerende regulatorer valideres ved hjælp af andre udlæsninger for deres transskriptionsfaktoraktivitet.

Effektiv knockdown af den identificerede regulator ved analysen bør også bekræftes. Husk at være forsigtig og følge sikkerhedsretningslinjerne, når du arbejder med infektiøse lentivirus, især hvis virus er menneskelige infektiøse.

Summary

Automatically generated

For at identificere nye regulatorer af transskription faktorer, vi udviklet en tilgang til at screene arrayed lentiviral eller retroviral RNAi biblioteker ved hjælp af en dual-luciferase-baserede transskriptions-reporter assay. Denne tilgang tilbyder en hurtig og relativt billig måde at screene hundredvis af kandidater i et enkelt eksperiment.

Read Article