Het genereren van gecontroleerde, dynamische chemische landschappen om microbieel gedrag te bestuderen

Deze methode maakt het mogelijk om de microschaal ecologie en het gedrag van micro-organismen navigeren dynamische chemische gradiënten te verduidelijken en om hun verborgen trade-offs, nutriënten kinetiek, en de dynamiek van de bevolking in ecologisch relevante micro-omgevingen te ontdekken. Door microfluïde technologie te combineren met fotolyse, genereren we gecontroleerde chemische pulsen, waarbij gelokaliseerde chemoattractant plotseling beschikbaar komt op microschaal, om de chemotactische respons van microbiële populaties te meten die voor het eerst werden blootgesteld aan onstabiele chemische gradiënten. Ontwerp het kanaal met CAD-software en print het op een transparantiefilm om het fotomasker te maken.

Fabriceer de meester door zachte lithografie in een schone kamer, volgens het manuscript. Bereid een PDMS-mengsel door het elastomeer te combineren met zijn uithardingsmiddel met een 10-op-een verhouding in een bekerglas van 40 milliliter. Meng met een plastic mes krachtig tot de vloeistof homogeen is.

Ontgassen het PDMS-mengsel onmiddellijk gedurende 45 minuten in een vacuümkamer bij kamertemperatuur. Om het proces te versnellen, periodiek laat het vacuüm om de bubbels die zich vormen op de interface barsten. Verwijder stof van het oppervlak van de meester met een reiniger onder druk.

Giet vervolgens het ontgassen PDMS-mengsel op de meester en bak het twee uur in een oven op 80 graden Celsius. Snijd de PDMS met een mes rond de microstructuren op een afstand van ongeveer vijf millimeter, en dan voorzichtig schil de PDMS van de meester. Punch gaten om te dienen als de inlaat en uitlaat van de microchannel.

Verzegel het microkanaal met plakband om ophoping van stof te voorkomen. Ontwerp de 3D-vorm met behulp van 3D-ontwerpsoftware en print de master voor de PDMS-mal met een 3D-printer met hoge resolutie. Na het voorbereiden en ontgassen van het PDMS-mengsel zoals eerder gedaan, reinigt u het oppervlak van de meester door te deppen met plakband.

Zet de meester op een weegschaal. Vervolgens, terwijl het vermijden van het centrale gebied van de meester, giet 23,4 gram van ongecureerd PDMS mengsel om de gewenste hoogte van PDMS te verkrijgen door het afstemmen van de hoogte van de meester op 0,5 millimeter. Verwijder de resterende bellen met behulp van perslucht.

Plaats de PDMS gegoten op de meester in een oven op 45 graden Celsius om te bakken voor ten minste 12 uur. Dan, voorzichtig schil van de geharde PDMS laag, en punch inlaat en uitlaat gaten voor de injectie van de bacteriële suspensie. Activeer zowel het oppervlak van een petrischaal als de PDMS-mal met zuurstofplasma gedurende twee minuten.

Bond de PDMS mal op de Petri schotel door zachtjes druk op de mal aan de Petri schotel. Houd niet in op de plaats waar de functies zich bevinden. Plaats de petrischaal gebonden aan de PDMS 3D-mal in een oven op 45 graden Celsius gedurende ten minste 12 uur om de chemische binding te versterken.

Activeer vervolgens het nanoporeus polycarbonaatmembraan in een zuurstofplasmakamer gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Verdun onder een chemische kap een commerciële oplossing van 3-aminopropyltriethoxysilane in gedeïoniseerd water tot 1% in volume met behulp van een polypropyleenbuis. Breng de verdunde 3-aminopropyltriethoxysilane-oplossing over in een petrischaaltje en dompel het geactiveerde membraan gedurende 20 minuten onder in de 3-aminopropyltriethoxysilaneoplossing.

Verwijder vervolgens het membraan uit de 3-aminopropyltriethoxysilane-oplossing met een pincet en plaats het op een schone kamer om te drogen. Voor de fabricage van de PDMS microfluïde kanalen die op het membraan liggen en het wassen van de bacteriële arena mogelijk maken, herhaal de fabricage van het microfluïde apparaat voor het enkele chemische pulsexperiment zoals eerder gedaan. Om de PDMS-waskanalen aan het gefunctionaliseerde membraan te binden, activeert u eerst twee minuten lang zowel het PDMS-waskanaal als het polycarbonaatmembraan met een zuurstofplasmakamer.

Breng onmiddellijk na de plasmabehandeling het gefunctionaliseerde membraan en het PDMS-waskanaal in contact door het PDMS-waskanaal voorzichtig op het membraan te drukken. Het is belangrijk om de PDMS en het membraan voorzichtig tegen elkaar te drukken, of het membraan kan onomkeerbaar worden gebonden aan het plafond van de PDMS-microkanaal van 200 micrometer. Activeer vervolgens zowel het gebonden laminaat PDMS waskanaal polycarbonaat membraan als de 3D PDMS mal eerder gebonden aan de petrischaal door ze te plaatsen in een zuurstof plasma kamer gedurende twee minuten.

Sandwich het membraan tussen twee PDMS lagen, en druk samen. Plaats de petrischaal gebonden aan de sandwich structuur in een oven op 45 graden Celsius voor ten minste 12 uur om de chemische binding te versterken. Om te beginnen moet u de millifluïde kamer gedurende 20 minuten onder vacuüm houden.

Plaats vervolgens de petrischaal met de millifluïde kamer op een microscooppodium. Vul met een pipet de kamer onder het membraan met de verdunde bacteriële suspensie van GFP-fluorescerende Vibrio ordalii in één millimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-gekooide-L-glutamaatoplossing in kunstmatig zeewater. Na het vullen van het kanaal met de bacteriële suspensie, zuig de oplossing in overmaat met een papieren handdoek, en verzegel inlaat en uitlaat met PDMS pluggen door ze voorzichtig te drukken in de gaten.

Vul een spuit met een kunstmatige zeewateroplossing van één millimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamaat, en bevestig buizen aan de inlaat en uitlaat van het waskanaal boven het membraan. Sluit de slang aan op een afvalreservoir en zorg ervoor dat de slang volledig onder water staat in het vloeistofafvalreservoir om drukschommelingen te voorkomen. Stel de stroomsnelheid op de spuitpomp in op 50 microliter per minuut.

Start de spuitpomp om de stroming in het waskanaal boven het membraan vast te stellen. Start de software die de LED-straal en de microscoopfase aanst handt en genereer door de gebruiker gedefinieerde sequenties van pulsen op verschillende locaties en met verschillende intensiteiten. Neem video op met behulp van een 4x-doelstelling op regelmatige tijdstippen over een periode van enkele uren en over meerdere aaneengesloten locaties om een groot oppervlak te bedekken.

In deze studie werden de microfluïde en millifluïde apparaten gebruikt om bacteriële chemotactische respons en accumulatieprofielen te bestuderen onder dynamische voedingsomstandigheden. Maximale intensiteitsprojecties tonen de bacteriële positie, aangegeven door witte sporen, over een interval van 0,5 seconden onmiddellijk na de pulsafgifte en 40 seconden na de pulsontslag. De bacteriële trajecten werden ook weergegeven in het zwart 60 seconden na de puls release.

Het schaduwrijke gebied vertegenwoordigt de chemische impuls die door fotolyse op tijd nul seconde in het midden van het gebied van mening wordt vrijgegeven, dat later verspreidde. De bacteriële concentratie, evenals de temporele dynamica van de radiale afwijkingssnelheid na een impulsversie in het centrum van het gezichtsveld worden hier getoond. Negatieve waarden van de driftsnelheid komen overeen met gerichte chemotactische beweging naar het midden van de puls.

Zwemstatistieken worden hier gepresenteerd voor een bacteriële populatie bij afwezigheid van chemische gradiënten. Trajecten vertegenwoordigen de tweedimensionale projecties van de driedimensionale bacteriële beweging in het microkanaal. De waarschijnlijkheidsverdeling van gemeten bacteriële het zwemmen snelheid werd geschikt door een gammadistributie.

Uit de bacteriële trajecten werd de waarschijnlijkheidsverdeling van de tijd tussen opeenvolgende heroriëntaties geëxtraheerd. Het heroriëntatiepatroon, de verdeling van de zwemsnelheid en de heroriëntatiestatistieken van de organismen werden gebruikt om een individueel gebaseerd model te informeren. Deze methode is getest op de mariene bacteriën Vibrio ordalii het uitvoeren van chemotaxi’s in de richting van het aminozuur glutamaat, maar de voorgestelde methode is in grote lijnen toepasbaar op verschillende combinatie van soorten en chemoattractants, evenals op biologische processen buiten chemotaxis, zoals populatie en gemeenschapsdynamiek in ruimtelijk heterogene en dynamische omstandigheden.

Klassieke technieken in microbiële ecologie en microbiologie, zoals gezwellen in batchculturen of chemostats, hebben de spatio-temporele kenmerken van microbiële habitats grotendeels genegeerd. De bijna-onmiddellijke creatie van chemische pulsen op de microschalen door middel van fotolyse heeft tot doel het type nutriëntenpulsen te reproduceren dat mariene bacteriën in het wild tegenkomen uit verschillende bronnen, bijvoorbeeld de verspreiding van pluimen achter zinkende organische deeltjes of de voedingsstof die zich verspreidt uit lysed fytoplanktoncellen. De aminosilane oplossing is acuut giftig en moet met uiterste zorg worden behandeld.

We werken uitsluitend onder de rookkap en dragen beschermende apparatuur zoals labcoat, veiligheidsbril en handschoenen. We zorgen ook voor het afval dat we hebben gegenereerd.