Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Rening och analys av Caenorhabditis elegans Extracellulära blåsor
Chapters
Summary March 31st, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denna artikel presenterar metoder för att generera, rena och kvantifiera Caenorhabditis elegans extracellulära blåsor.
Transcript
Det extracellulära vesikelfältet har saknat genetiskt tractable ryggradslös modell för att studera protein och RNA signaler extracellulära vesiklar. Detta protokoll fastställer metoderna för att erhålla rikliga, rena extracellulära vesiklar från C.elegans. Detta är tillräckligt för robust RNA-SEQ och proteomisk analys.
När den synkroniserade kulturen C.elegans har uttömt maten från sin normala tillväxt medium platta, använd gummiband för att säkra en fem mikrometer nylon mesh filterlock på en steril flaska och starta ett vakuum. Häll L1 maskarna på filtret och passera en lika stor volym av medium över masken aggregat. Efter vortexing, överföra tre 10 mikroliter volymer av masken suspension på en mask odling tallrik lock och räkna antalet djur i varje droppe.
Justera maskupphängningen till två djur per mikroliter av färskt medium och vortexa suspensionen igen. Därefter lägger du till nio, 10 mikroliterdroppar maskar på ett nytt tallrikslock och räknar manuellt antalet djur i varje droppe. Beräkna sedan medelvärdet och standardfelet för medelvärdet i procent av varje maskpopulation och beräkna det totala antalet djur i varje population.
För att förbereda maskarna för e-talsgenerering, tvätta maskarna med tre fem minuters tvättar i 15 milliliter sterila M9 medium med 50 mikrogram per milliliter carbenicillin per tallrik per tvätt med mild virvlande att rubba maskarna, poolning tvättarna i en 50 milliliter konisk rör. Efter den sista tvätten, späd maskarna till ett ett djur per mikroliter av S-Basel lösning kompletteras med 2,5 mikrogram per milliliter kolesterol och 50 mikromolar karbillin koncentration. Tillsätt sedan upp till 400 milliliter av masken suspension till en steril två liters botten förbryllad kolv.
Placera kolven på en cirkulär rotator vid 20 grader Celsius och 100 rotationer per minut under 24 timmar. För extracellulär vesikelskörd, överför maskarna i ett koniskt rör på 50 milliliter för centrifugering och dekantera supernatanten genom ett 0,22 mikrometer vakuumfilter för att avlägsna eventuellt partikelspillror. Efter att ha räknat, placera en droppe upphängda maskar på en bakteriell gräsmatta och poäng djuren som rörliga, förlamad, eller död efter 15 minuter.
Därefter koncentrerar filtrerade supernatant till 700 mikroliter med en regenererad nitrocellulosa 10 kilodalton molekylär vikt cutoff filter och lägga till 150 mikroliter av färsk S-Basel lösning till minskningen. Filtrera och vortexa den resulterande lösningen och upprepa minskningen och filtreringen ytterligare två gånger som bara visat. Efter den sista filtreringen, centrifugera supernatanten för att avlägsna eventuella partiklar och skräp som kan ha ackumulerats under hanteringen och lägg till proteashämmare cocktail plus EDTA enligt tillverkarens instruktioner.
För att förbereda storlek uteslutning kolumnen, dekantera 15 milliliter av suspenderad agaros harts i en tom gravitation flöde kolumn patron. När kolonnen har dränerats, tillsätt S-Basel-lösning tills hartsbädden är packad med en slutvolym på 10 milliliter. Byt ut hartsbufferten med 40 milliliter sterilt filtrerad S-Basel-lösning, var noga med att inte störa hartsen, och låt gravitationen dränera bufferten genom kolonnen.
När toppen av hartset inte längre är nedsänkt, locket botten av patronen för att stoppa flödet och placera en samling röret under kolumnen. För att inleda esöndringsfraktionation, ta bort locket och omedelbart lägga till koncentrerad utsöndringslösning drop-wise till toppen av kolumnen sängen, följt av tillägg av en milliliter av S-Basel lösning drop-wise. Placera ett nytt uppsamlingsrör under kolonnen och fyll långsamt den övre kolonnbehållaren med fem milliliter S-Basel-lösning.
Efter att ha samlat de två första milliliterna av eluat, snabbt byta rören för att samla de kommande fyra milliliter. Använd ett regenererat nitrocellulosa 10 kilodalton molekylvikt cutoff spin filter för att koncentrera extracellulära vesikel som innehåller kolumn eluat till 300 mikroliter och överföra filtret retentate till en låg bindande mikrocentrifuge rör. Tvätta sedan filtermembranet två gånger med 100 mikroliter S-Basel-lösning vid 20 sekunders virvelning per tvätt och kombinera tvättarna med originalrektatet för en slutlig provvolym på 500 mikroliter.
För att förbereda de extracellulära vesiklarna för kvantifiering genom flödescytometrisk analys, tillsätt 840 mikroliter av S-Basel-lösning och 60 mikroliter av renade extracellulära vesiklar till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 300 mikroliter av provet i två ytterligare mikrocentrifugrör tillsammans med sju mikroliter av en lämplig potentiometrisk sond per rör. Tillsätt sju mikroliter på 1%Triton X-100 till det sista röret och blanda alla rör genom att vortexa.
Placera en sonicator spets i mitten av röret av det tredje provet och puls provet 10 gånger vid 20%effekt och en 30%duty cykel. Därefter lägger 300 mikroliter av S-Basel lösning till två kontroll mikrocentrifugrör och tillsätt sju mikroliter av sond till färgämnet enda röret. Märk det andra röret Endast buffert.
Sedan inkubera alla rör i en timme vid rumstemperatur skyddas från ljus innan deras analys genom flödescytometri enligt standardprotokoll. För att analysera data, öppna filerna i lämplig flödescytmetrisk analys programvara. Ställ in en rektangulär grind med början längst upp på tomten som sträcker sig från den lilla vinkelljusspridarens nivå på en gång 10 till de två till en gånger 10 till de fyra och föra porten ner tills den innehåller cirka 2,5%av de totala händelserna.
Namnge porten efter sonden och kopiera och klistra in porten på de andra två prov- och kontrolldatariterna. Exportera sedan analysen till ett kalkylblad. Här visas representativa resultat från 10 biologiska replikat.
Variabiliteten mellan replikat är inte signifikant och det typiska standardfelet av medelvärdet av populationens storlek är lite över 10%Överföringen av djur mellan plattorna resulterar i ungefär en 10%-förlust av djur, medan cirka 20%av djuren går förlorade i sackaros flotationssteget. I genomsnitt kommer 1 000 unga vuxna djur av vildtyp att utsöndra ett mikrogram proteiner som är större än 10 kilodalton i sin omgivning. När denna fraktion separeras ytterligare av storlek uteslutning kromatografi, visar den totala protein eluering profil en liten protein topp mellan två till sex milliliter och en stor topp efter åtta milliliter.
De extracellulära vesiklarna finns inom de första fem milliliterna av kolonnen eluat. I en direkt jämförelse av flödescytometriska egenskaper mellan C.elegans och mänskliga extracellulära vesiklar visar ett histogram av C.elegans extracellulära vesikelprovshändelser, sorterade efter ljusspridning med liten vinkel, att alla preparaten når sin kulmen vid en fluorescensintensitet på ungefär en gång 10 till den tredje. Den potentiometriska sonden DI-8-ANEPPS, robust etiketter C.elegans extracellulära vesiklar och överflödet av renad extracellulära vesiklar sorterade efter DI-8-ANEPPS uttryck är inte signifikant olika mellan C.elegans och cellkultur härledda preparat.
De prover som utarbetats av detta förfarande är mottagliga för alla typiska nedströms extracellulära vesikelanalysmetoder, inklusive RNA-SEQ, flödescytometri, nano-partikelspårningsanalys och proteomisk analys. Upprättande av metoder för att rena C.elegans extracellulära vesiklar gör det möjligt för forskare att använda denna enkla ryggradslösa modell för att studera de genetiska vägar och fysiologiska processer som påverkar extracellulära vesikel last sammansättning.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
