Het verkrijgen van hoogwaardige transcriptoomgegevens van graanzaden door middel van een gewijzigde methode voor genexpressieprofilering

Deze microarray hybridisatiemethode is handig voor het vergelijken van een groot aantal monsters van een organisme met een bekend genoom. Vergeleken met een hoge doorvoer sequencing aanpak, de hoeveelheid gegevens gegenereerd door deze methode is veel gemakkelijker te hanteren en verder, het kan worden geanalyseerd in een meer kosteneffectieve manier. Het aantonen van de procedure zal Dr.Christiane Seiler een post-doctorale wetenschapper die werkzaam is in de onderzoeksgroep bij Rosis op de IPK in Gatersleben.

Voordat u microarray-hybridisatie uitvoert met behulp van de genexpressiehybrideisatiekit, bereidt u 10X-blokkeringsmiddel volgens de specificaties van de fabrikant en aliquot het resulterende blokkeringsmiddel in 200 microlitervolumes. Bewaar vervolgens de blokkeringsagent bij min 20 graden Celsius tot gebruik. Op de dag van de microarray hybridisatie ontdooit u een 200 microliter van het 10X-blokkeringsmiddel op ijs en verwarmt u de hybridisatieoven tot 65 graden Celsius en een warmteblok tot 60 graden Celsius.

Bereid de fragmentatiemix voor elk monster zoals beschreven door de fabrikant en meng de monsters voorzichtig op een vortex. Na het vortexen, kort spin de monsters in een microcentrifuge voordat het uitbroeden voor precies 30 minuten in de 60 graden Celsius warmteblok. Aan het einde van de incubatie, onmiddellijk afkoelen elke buis op ijs voor een minuut voor het stoppen van de fragmentatie met 25 microliters van 2X gen expressie hybridisatie buffer, hoge omwentelingen per minuut per buis.

Meng met zachte pipetting, waarbij grote zorg om geen bubbels te introduceren, en centrifugeren de buizen in omgevingstemperatuur. Aan het einde van de spin onmiddellijk plaats alle buizen op ijs en laad elk monster in de microarray glijbaan zo snel mogelijk. Vervolgens langzaam afzien van 44 microliters van elke hybridisatie mix in het midden van elke pakking goed, zorg ervoor dat de invoering van bellen te voorkomen, en voeg 44 microliter hybridisatie buffer in een ongebruikte putten.

Plaats onmiddellijk de microarray schuif in de juiste richting op de top van de pakking dia, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen vloeistof morsen, en sluit de hybridisatie assemblage. Draai de montage om het ontbreken van stationaire luchtbellen te bevestigen en plaats de hybridisatiekamerassemblage in de ver hybridisatieoven rotator. Stel de rotatiesnelheid in op 10 omwentelingen per minuut en start de hybridisatie op 65 graden Celsius gedurende precies 17 uur.

Terwijl de monsters zijn hybridiseren, bereiden drie wasschaal assemblages in de juiste wasbuffers zoals beschreven in de tabellen. Na precies 17 uur van hybridisatie, demonteren een hybridisatie kamer op een lab bank bekleed met pluisvrij papier en breng een microarray sandwich naar een schotel met wasbuffer een met de microarray barcode naar boven in een schuine positie zonder het onderdompelen van de hele dia in de buffer. Met behulp van tangen, scheiden van de twee glazen dia’s en laat de pakking glijden zachtjes in de bodem van de schotel, terwijl het houden van een stevige greep op de microarray glijbaan.

Til de microarray-schuif langzaam zijwaarts op voor onmiddellijke overdracht in het microarray-rek in schotel twee met een minimale blootstelling aan de lucht. Wanneer alle acht glijbanen gelijkmatig langs het rek zijn geplaatst, bevestigt u de rekhouder en breng u de gehele schotel twee opstelling aan de magneetroerder. Roer de setup precies één minuut zachtjes.

Terwijl de monsters worden geroerd, breng schotel drie van de 37 graden Celsius incubator op een tweede magnetische roerder. Voeg vervolgens voorzichtig 37 graden Celsius wasbuffer twee tot schotel drie zonder het vormen van bellen. Breng aan het einde van de roerende incubatie het schuifrek voorzichtig en langzaam over op schotel drie en verwijder de rekhouder.

Na het roeren voor precies een minuut, langzaam en voorzichtig verwijder de schuifrek uit de schotel en gebruik pluisvrij papier om zorgvuldig te drogen beide zijden van elke dia, het plaatsen van elke dia in een diadoos als het wordt gedroogd. Nadat de dia’s 15 minuten hebben laten drogen, brengt u elke microarray-dia in een diahouder met de streepjescode naar boven en laadt u de geassembleerde schuifhouders in een scancarrousel en volgorde volgens het streepjescodenummer. Scan vervolgens onmiddellijk de dia’s.

In dit cijfer wordt een representatief resultaat van een run getoond om de kwaliteit van RNA-extractie te testen. In typische analyses van monsters met een laag zetmeelgehalte, zoals gerstbladeren, zijn extra ribosomale RNA-banden van chloroplasten zichtbaar. Monsters met een hoog zetmeelgehalte, zoals gerstzaden, vertonen 18 en 28S ribosomale RNA.

Houd er rekening mee dat er geen geautomatiseerde RNA-integriteitsnummerwaarde kan worden berekend voor groene plantenweefsels, zoals bladmonsters, als gevolg van chloroplast ribosomale RNA. In deze representatieve analyse werden een RNA-voorbereiding en hybridisatie naar een op maat gemaakte gerstmicroarray-chip uitgevoerd zoals aangetoond. Het raster toont een voorbeeld van afgeleide signalen uit elke hoek van de chip, inclusief achtergrond en piek in uitleespunten die worden gebruikt voor kalibratie.

Het histogram geeft de afwijking aan van detecteerbare stippen met respectievelijke signaalintensiteiten. Zoals waargenomen, een succesvolle hybridisatie geeft een brede Gaussian-vormige curve met slechts kleine uitschieters. Hier wordt het kwaliteitscontrolerapport voor gedetecteerde signalen weergegeven.

De waarden voor de gehybridiseerde dia worden gegeven in kolom twee en het bereik van aanvaardbare waarden wordt weergegeven in kolom vier. Deze methode kan worden gebruikt voor het aanpakken van elk experimenteel opgezet voor elk organisme waar substantiële informatie over het genoom beschikbaar is. Met behulp van deze techniek in ons lab konden we transcriptomische veranderingen in rijst en gerst die optreden na groeistress inductie vergelijken en analyseren.