קבלת נתונים באיכות גבוהה טראנסקריפט מזרעי דגנים על ידי שיטה שהשתנתה ליצירת פרופיל ביטוי גנים

שיטת הכלאה microarray זה שימושי להשוואת מספר רב של דגימות אורגניזם עם גנום ידוע. בהשוואה לגישה של רצף תפוקה גבוהה, כמות הנתונים שנוצרת על ידי שיטה זו היא הרבה יותר קלה לטיפול ועוד, ניתן לנתח אותה בצורה חסכונית יותר. הפגנת ההליך תהיה ד”ר כריסטיאן סיילר, פוסט-דוקטורט, שעובדת בקבוצת המחקר ברוזיס ב-IPK בגאטרסלבן.

לפני ביצוע הכלאה microarray באמצעות ערכת הכלאה ביטוי גנים, להכין סוכן חסימה 10X על פי מפרט היצרן aliquot סוכן חסימה וכתוצאה מכך 200 כרכים microliter. לאחר מכן, לאחסן את סוכן החסימה במינוס 20 מעלות צלזיוס עד השימוש. ביום ההכלאה microarray, להפשיר אחד 200 aliquot microliter של סוכן חסימה 10X על קרח לפני המלחמה את תנור ההכלאה ל 65 מעלות צלזיוס וגוש חום ל 60 מעלות צלזיוס.

הכינו את תערובת הפיצול לכל דגימה כפי שתוארה על ידי היצרן וערבבו את הדגימות בעדינות על מערבולת. לאחר מערבולת, לזמן קצר לסובב את הדגימות במיקרוצנטריפוגה לפני הדגירה בדיוק 30 דקות בבלוק חום 60 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, מיד לקרר כל צינור על קרח במשך דקה אחת לפני עצירת הפיצול עם 25 microliters של חיץ הכלאה ביטוי גנים 2X, מהפכות גבוהות לדקה לכל צינור.

מערבבים עם צינורות עדינים, דואגים מאוד לא להציג בועות, וצנטריפוגה הצינורות בטמפרטורת החדר הסביבה. בסוף הספין מיד מניחים את כל הצינורות על הקרח ועומסים כל דגימה לתוך מגלשת המיקרו-ריי מהר ככל האפשר. לאחר מכן, מחלקים באיטיות 44 מיקרוליטרים של כל תערובת הכלאה למרכז כל באר אטם, דואגים להימנע מהכנסת בועות, ומוסיפים 44 מיקרוליטרים של מאגר הכלאה לתוך כל בארות שאינן שימוש.

מיד למקם את השקופית microarray בכיוון הנכון על גבי מגלשת אטם, דואג לא לשפוך כל נוזל, ולסגור בחוזקה את הרכבה הכלאה. סובב את ההרכבה כדי לאשר את המחסור בבועות אוויר נייחות והצב את הרכבת תא ההכלאה לתוך מסובב תנור ההכלאה. הגדר את מהירות הסיבוב ל 10 מהפכות לדקה, ולאחר מכן להתחיל את ההכלאה ב 65 מעלות צלזיוס בדיוק 17 שעות.

בזמן שהדגימות היברידיות, הכינו שלוש הרכבות של כלי שטיפה במאגרי הכביסה המתאימים כמתואר בשולחנות. לאחר 17 שעות בדיוק של הכלאה, לפרק תא הכלאה אחד על ספסל מעבדה מרופד נייר מוך חינם ולהעביר כריך microarray אחד לצלחת המכילה חיץ לשטוף אחד עם ברקוד microarray פונה כלפי מעלה בתנוחה מלוטה מבלי להטביע את כל השקופית במאגר. באמצעות מדפים, להפריד את שתי מגלשות זכוכית ולתת את הגלישה אטם טיפה בעדינות לתוך החלק התחתון של המנה תוך שמירה על אחיזה איתנה על שקופית microarray.

הרם באיטיות את החלקת המיקרו-ריי הצידה להעברה מיידית לתוך מתלה המיקרו-ריי בצלחת 2 עם חשיפה מינימלית לאוויר. כאשר כל שמונה השקופיות הונחו באופן שווה לאורך המדף, חבר את מחזיק המדף והעבר את כל המנה 2 לערבב המגנטי. מערבבים את ההתקנה בעדינות במשך דקה אחת בדיוק.

בזמן שהדגימות מעורבבות, מעבירים את המנה השלישית מהאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס על גבי ערבוב מגנטי שני. לאחר מכן מוסיפים בעדינות 37 מעלות צלזיוס לשטוף את המאגר 2 כדי צלחת שלוש מבלי להרכיב בועות. בסוף הדגירה המרגשת, מעבירים בעדינות ובאט לאט את מתלה השקופיות לצלחת שלוש ומסירים את מחזיק המדף.

לאחר ערבוב של דקה אחת בדיוק, מסירים באיטיות ובעדינות את מתלה השקופיות מהצלחת ולהשתמש בנייר חופשי מוך כדי לייבש בזהירות את שני הצדדים של כל שקופית, הצבת כל שקופית לתוך תיבת שקופית כפי שהוא מיובש. לאחר מתן אפשרות לשקופיות להתייבש למשך 15 דקות, העבר כל שקופית microarray למחזיק שקופית כאשר הברקוד פונה כלפי מעלה וטען את מחזיקי השקופיות שהורכבו לקרוסלה ורצף סריקה בהתאם למספר הברקוד. לאחר מכן, סרוק מיד את השקופיות.

בנתון זה, תוצאה מייצגת של ריצה כדי לבדוק את האיכות של מיצוי RNA מוצג. בניתוחים אופייניים של דגימות תוכן עמילן נמוך, כגון עלי שעורה, להקות RNA ריבוזומליות נוספות מכלורופלסטים ניכרות. דגימות תוכן עמילן גבוה, כגון זרעי שעורה, התערוכה 18 ו 28S ריבוזומלי RNA.

שים לב כי לא ניתן לחשב ערך אוטומטי של מספר שלמות RNA עבור רקמות צמחיות ירוקות, כגון דגימות עלים, עקב RNA ריבוזומלי כלורופלסט. בניתוח מייצג זה, הכנת RNA והכלאה לשבב microarray שעורה מותאם אישית בוצעו כפי שהוכח. הרשת מציגה דוגמה לאותות נגזרים מכל פינה של השבב, כולל רקע ודקר בנקודות קריאה המשמשות לכיול.

ההיסטוגרמה מציינת את הסטייה של נקודות הניתנות לגילוי עם עוצמת אות בהתאמה. כפי שנצפה, הכלאה מוצלחת מעניקה עקומה רחבה בצורת גאוסיאנית עם חריגים קטנים בלבד. מוצג כאן דוח בקרת האיכות עבור אותות שזוהו.

הערכים עבור השקופית הכלאית ניתנים בעמודה 2 וטווח הערכים הקביים מוצג בעמודה ארבע. שיטה זו יכולה לשמש לטיפול בכל הגדרה ניסיונית עבור כל אורגניזם שבו מידע משמעותי על הגנום זמין. שימוש בטכניקה זו במעבדה שלנו אפשר לנו להשוות ולנתח שינויים תעתיק באורז ושורה המתרחשים לאחר אינדוקציה מתח הצמיחה.