Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Beredning av meiotiska kromosom sprider sig från Zebrafish Spermatocytes
Summary March 3rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Kärnytan sprider sig är ett oumbärligt verktyg för att studera kromosom händelser under meios. Här demonstrerar vi en metod för att förbereda och visualisera meiotiska kromosomer under profas I från zebrafiskar spermatocyter.
Transcript
Zebrafish växer fram som en utmärkt ryggradsdjur modell för att studera kromosom händelser av meios inklusive homolog kromosom ihopkoppling, synapsis och rekombination. Denna nukleära yta spridning protokoll har gjort det möjligt för oss att visualisera viktiga funktioner i meiotisk kromosom arkitektur med hjälp av super upplösning mikroskopi. Forskare kan förvänta sig hundratals välspillliga kärnor per bild med mindre skräp än andra zebrafiskar sprida protokoll.
Den mest tekniskt utmanande delen av detta förfarande är dissekering av zebrafisktestes som det är i nära anslutning till huden och är också fäst vid andra organ. Visualisera dissekeringsförfarandet gör det möjligt för forskare att veta vad som väntar när de ser gonad inbäddade i vävnaden av djuret. Efter att avliva manliga zebrafiskar, halshugg en fisk i taget med små saxar och använd sedan mikrosax för att skära längs den ventrala mittlinjen för att exponera kroppshålan.
Placera fisken i en silikonbelagd petriskål och täck över av en grund pool på 1X PBS. Under ett mikroskop vid 1,65X förstoring, dissekera testikorna med hjälp av tövövyper. Ta bort så mycket som fett och omgivande vävnad från testikorna som möjligt.
Den gonad kommer att visas genomskinlig under dissektionen omfattning ljus medan det omgivande fettet kan ha en något mörkare utseende. Viss mängd fett kan lämnas på gonad utan att det innebär att förfarandet. Tillsätt varje dissekerade testiklar direkt i ett fem milliliter rör med två milliliter DMEM och hålla på is.
För att dissocierera testikalcellerna, tillsätt 200 mikroliter av kollagenaslösning till fem milliliterröret med testikalerna. Blanda lösningen genom att invertera den flera gånger. Skaka försiktigt testikorna i en inkubatorskaktör horisontellt vid 100 RPM vid 32 grader Celsius.
Snabbt invertera röret var 10:e minut för att underlätta dissociation. Efter en timme är DMEM grumlig och testikorna är i små bitar. Medan testikorna inkuberas i kollagenas, förkrigstiden 100 mikroliter av 0,1 molar sackaros lösning till 37 grader Celsius.
För att tvätta ur kollagenasen, tillsätt DMEM till en slutlig volym på fem milliliter och invertera röret några gånger. Pellet testikorna vid 200 g i tre minuter vid rumstemperatur. Ta bort tre milliliter av supernatanten så att endast två milliliter återstår.
Upprepa DMEM-tvätten ytterligare två gånger. Efter den sista DMEM tvätta, ta bort fyra milliliter av supernatanten och tillsätt en milliliter DMEM, 200 mikroliter trypsinlösning, och 20 mikroliter DNase I-lösning. Invertera röret några gånger för att blanda lösningen.
Horisontellt skaka röret vid 32 grader Celsius vid 100 RPM. Snabbt invertera röret var femte minut för att underlätta dissociation. Efter fem till 15 minuter innehåller DMEM-lösningen endast några få klumpar.
Tillsätt 500 mikroliter av trypsinhämmarlösningen och 50 mikroliter DNase I-lösning. Invertera röret några gånger för att blanda sedan kort snurra ner vid 200 g i tre minuter vid rumstemperatur för att ta bort vätska eller klumpar som kan hålla sig till rörlocket eller sidan av röret. Placera röret på is och resuspend cellen suspensionen genom upprepade pipett upp och ner med en plast överföring pipett i två minuter för att underlätta dissociation av eventuella kvarvarande klumpar.
Se till att cellfjädringen inte går in i glödlampan på överföringspipetten. Sedan pre-wet en 100 mikron cell sil med DMEM och placera den på toppen av en 50 milliliter rör på is. Överför cellfjädringen genom silen en droppe i taget med hjälp av en plasttransferpipett.
Överför filtratet med hjälp av en plasttransferpipett till ett nytt fem milliliterrör. Se till att samla ihop de poolade cellerna som är kopplade till undersidan av filtret. Lägg till DMEM i röret till en slutvolym på fem milliliter.
Pellet cellerna på 200 g i fem minuter vid rumstemperatur. Ta bort så mycket supernatant som möjligt utan att störa pelleten och tillsätt fem mikroliter av DNase I-lösning direkt i pelleten. Blanda sedan pelleten med DNase I-lösningen genom att försiktigt skrapa utsidans botten av röret fyra till fem gånger längs ett tomt mikrocentrifugrörsställ.
Lägg till DMEM till en slutvolym på fem milliliter och blanda lösningen genom att invertera röret flera gånger. Pellet cellupphängningen vid 200 g i två minuter i rumstemperatur. Upprepa DNase-behandlingen ytterligare en till tre gånger tills den återanvända pelleten inte klumpar ihop sig vid tillsats av DMEM.
Efter det sista snurret, ta bort så mycket supernatant som möjligt utan att pelleten störs. Lägg därefter till en milliliter av 1X PBS och resuspend pelleten genom att försiktigt skrapa utsidan botten av röret längs en tom tub rack. Pellet cellupphängningen vid 200 g i fem minuter och ta sedan bort så mycket supernatant som möjligt utan att störa pelleten.
Skär tre millimeter från slutet av en 200 mikroliter pipett spets för att vida bländaren. Med den skurna pipettspetsen, resuspend pelleten i 80 mikroliter av 0,1 molar sackaroslösning genom pipettering upp och ner. Låt cellupphängningen sitta i rumstemperatur i tre minuter.
Nästa, med en pipett spets, päls en bild med 100 mikroliter av 1%formaldehyd med 0,15%Triton X-100. Lägg sedan till 18 mikroliter av sackaroscellupphängningen på mitten av bilden i en rak linje vinkelrätt mot långsidan. Luta glidningen fram och tillbaka för att underlätta spridning av cellupphängningen till alla hörn.
Placera objektglasen platt ner i en något sprucken öppen fuktighetskammare för att förhindra att formaldehydlösningen torkar. Placera fuktighetskammaren i en mörk låda över natten. På morgonen tar du bort locket från fuktighetskammaren och låter objektglasen torka helt.
Placera diabilderna i en coplin burk och fyll sedan coplin burken med destillerat vatten. Inkubera i fem minuter med varsam skakning i rumstemperatur. Häll ut vattnet och fyll burken med ett till 250 vätmedel.
Tvätta två gånger i fem minuter vardera med varsam skakning i rumstemperatur. Låt objektglasen torka helt och förvara på minus 20 grader Celsius tills de är färgade. Detta protokoll beskrivs en metod för att förbereda och visualisera zebrafisk spermatocyte spridning som ger väl sprids icke-överlappande kärnor.
Panelerna till vänster visar tre stadier av meiotisk prophase, leptotene, tidig zygoten och pachytene. Telomerer var färgade magenta för varje steg. Ett exempel på dålig kvalitet sprider sig på grund av otillräcklig DNase I behandlingar visas här.
Meiotiska kromosomer som färgats för SYCP3 indikerar överlappande kärnor på grund av en viskös sackaroscellupphängning som förhindrar att celler sprids ordentligt på objektglaset. Det är mycket viktigt att börja med rätt mängd utgångsmaterial, behandla zebrafisktestes för lämplig tidsmängd i trypsin, och utföra det nödvändiga antalet DNase I behandlingar som underlåtenhet att göra det kan leda till mycket få kärnor eller hopklumpade kärnor. Korrekt PPE bör alltid bäras när man arbetar med formaldehyd.
Efter spridningsproceduren kan kromosomer färgas för att visualisera olika kromosomala strukturer samt dubbelsträngsbrytningar för att analysera tidsinställningsberoende och lokalisering av meiotiska händelser. Vår teknik har banat väg för att visa att zebrafiskar kan vara en bättre modell av mänsklig spermatogenes än mus baserat på kromosomfunktionerna och telomerbukten.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
