Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kombinert bruk av hale vene metastasering analyser og Real-Time in vivo Imaging å kvantifisere brystkreft metastatisk kolonisering og byrde i lungene
Chapters
Summary December 19th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Det beskrevet innfallsvinkel syndikatene eksperimentelle hale vene metastasering analyser med inne vivo bo dyr tenkelig å tillate virkelig-tid avlytting av brystkreften metastasering formasjon og oppblomstringen foruten kvantifisering av metastasering antallet og størrelse inne det lungen.
Transcript
Vår protokoll kan brukes til raskt og enkelt å teste rollen som ethvert kandidatgen i metastatisk kolonisering og vekst. Protokollen tillater også sanntidsovervåking av metastase, dannelse og vekst, samt kvantifisering av metastasenummer og størrelse hos de samme dyrene uten behov for reseksjon eller histoologisk farging. Plate fire T1 celler på 150,000 celler per brønn i en 12-brønns plate i komplett vekst media.
Inkuber ved 37 grader Celsius 5% karbondioksid over natten. Neste dag, aspirere vekstmediene fra cellene. Tilsett 500 mikroliter luciferase viral supernatant og 500 mikroliter fluorescerende protein viral supernatant å samtidig infisere cellene med både luciferase og fluorescerende protein viral supernativa.
Deretter legger du til en mikroliter på åtte milligram per milliliter heksametrinbromid og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 24 til 48 timer. Prøv å fikse de fire T1-cellene med 500 mikroliter trypsin. Etter to til fem minutter, overføre alle cellene til en seks centimeter rett i fire milliliter av utvalgsmedier, og dermed slukke trypsin.
Etter at valget er fullført, må du bekrefte at de infiserte fire T1-cellene uttrykker ZsGreen fluorescerende protein ved hjelp av et omvendt fluorescerende mikroskop ved 50 til 100 ganger forstørrelse. Bekreft også at de infiserte fire T1-cellene uttrykker luciferase ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig luciferase aktivitetssett. Fortsett å utføre optimalisering av in vivo eksperimentell design som beskrevet i tekstprotokollen.
Aspirer mediet og skyll celleplatene med 1X PBS. Prøvpsinize cellene med fem milliliter trypsin per 15 centimeter plate i to til fem minutter og overføre alle cellene til et konisk rør. Vask gjenværende celler fra vevskulturfatet med nok komplette vekstmedier til å slukke trypsin.
Tilsett vasken til samme koniske rør. Telle cellene ved hjelp av en automatisert celleteller for å bestemme det totale cellenummeret. Deretter sentrifuger cellene ved 122 ganger G i tre minutter, og aspirerer supernatanten.
Re-suspendere cellene i 1X PBS ved ønsket konsentrasjon. Her injiseres 25 000 celler i hver mus og 100 mikroliter PBS. Så de re-suspenderte cellene er på 250.000 celler per milliliter.
Hold cellesuspensjonene på is til injeksjon. Arbeide i en hette på dyreanlegget, forsiktig men grundig blande cellene ved å snu røret eller bruke en en en milliliter sprøyte for å sikre at de er jevnt suspendert. Last en en en milliliter Luer Lock sprøyte med cellefjæringen og fjern overflødige luftbobler.
Plasser en halv tomme 30 gauge nål på sprøyten med skråkanten opp og utvise luftbobler. Plasser forsiktig musen i et gnagerehold. Lateral halevenen skal være synlig og utvidet.
Hvis ikke, klyp forsiktig bunnen av halen og dypp halen i varmt vann fra springen for å utvide venene. Bruk en spritserviett til å rengjøre halen, sett deretter nålen inn i halevenen, skråsiden opp og injiser 100 mikroliter cellefjæring. Hvis nålen settes riktig inn i venen, bør den lett skyve litt forover og tilbake, og det bør ikke være motstand når stempelet skyves.
Vellykkede injeksjoner bør også resultere i en flush der den blå fargen på venen blir hvit i noen sekunder etter injeksjonen. Fjern nålen langsomt, og bruk en steril gasbind, påfør trykk på injeksjonsstedet for å stoppe blødning. Returner musen til buret og skjermen i 15 minutter for å sikre full gjenoppretting.
Slå på in vivo live dyr bildebehandling enheten, åpne bildeprogramvaren, og logg inn. Klikk initialiser-knappen og vent til maskinen initialiseres. Endre synsfeltet til D.For første gangs bruk redigerer du eksponeringsinnstillinger ved å klikke rediger, innstillinger, anskaffelse og automatisk eksponering.
Endre maksimal eksponeringstid fra standard 60 sekunder til 300 sekunder, og klikk ok. Legg en en milliliter sprøyte med D-luciferin, og tilsett deretter en halv tomme 30 gauge nål til sprøyten og utvise luftbobler. Mål og registrer massen av en bedøvet mus.
Hold musen ved å klemme scruff av nakken ved hjelp av tommelen og pekefingrene og gripe halen mellom pinky fingeren og bunnen av hånden. Inverter musen i en 45 graders vinkel med hodet pekende nedover. Sett nålen, skråsiden opp, inn i musens venstre side IP-plass.
Bekreft inntreden i IP-rommet ved å trekke tilbake et lite volum. Det bør ikke være farge på bunnen av nålen når du tegner tilbake i IP-rommet. Injiser riktig volum av D-luciferin for en dose på 150 milligram per kilo.
Umiddelbart etter administrering av D-luciferin, start en timer. Plasser musen flatt på ryggen i bildeenheten med nesen i nesekjeglen, og sørg for at den ene halvdelen til to og en halv prosent isofluran administreres. Klikk på selvlysende og fotografiske bokser.
Endre eksponeringstiden til automatisk, og klikk deretter hent i kontrollpanelet for anskaffelse. Etter avbildning, returnere musen til buret og overvåke i 15 minutter for å sikre full gjenoppretting. Etter eutanasi, som beskrevet i tekstprotokollen, isolere og fjerne lungene fra hver mus og skylle i 1X PBS for å fjerne overflødig blod.
Få bilder av ZsGreen metastaser i flikene på 10X i Brightfield og fluorescens ved hjelp av et fluorescerende stereoskop med et GFP-bredbåndfilter. Bruk bildeanalyseprogramvare til å kvantifisere størrelsen og antall metastaser fra bildene. For å behandle og analysere dataene fra bildene som er anskaffet med in vivo live animal imaging-enheten, åpne alle bildefiler for hver mus i bildeprogramvaren.
Kontroller at enhetene er i utstråling for bioluminescerende data og effektivitet for fluorescerende data ved å klikke pilen øverst til venstre i bildevinduet og endre den til riktig enhet. Bruk bildet fra forrige gangs punkt til å opprette et interesseområde, eller avkastning, ved først å klikke på roi-verktøy i verktøypalettvinduet. Deretter setter du inn en avkastning ved å klikke på pilen og velge en.
Klikk kantlinjen på avkastningen og flytt den over til brystet på musen. Juster størrelsen på avkastningen slik at den dekker brystet på musen og utelukker ikke signal. Klikk deretter måle ROIer og kopiere eller skrive inn rånummeret i et Excel-ark.
Plott inn og analyser dataene som beskrevet i tekstprotokollen. Høyreklikk i bildefilen for å kopiere avkastningen, og lim den deretter inn i bildefiler fra de andre tidspunktene og klikk mål ROM. Retroviral vektor som uttrykker tandem miR-30-baserte shRNAs rettet mot både YAP og TAZ reduserer YAP og skatteproteinuttrykk og transkripsjonsaktivitet i fire T1-celler.
Fire T1 luciferase celler ble stabilt transdusert med en ZsGreen uttrykker versjon av denne tandem YAP / TAZ shRNA vektor eller en kontrollert miR-30-basert shRNA. Bioluminescerende bilder viser at hastigheten som metastatisk byrde økte var signifikant raskere hos musene injisert med kontrollceller sammenlignet med musene injisert med YAP / TAZ knockdown celler. Et plott av log10 forvandlet luciferase signal målt for hver mus i løpet av eksperimentet viser også at hastigheten var raskere i musene injisert med kontrollcellene sammenlignet med musene injisert med YAP / TAZ knockdown celler.
Signifikant færre metastaser dannet hos musene injisert med YAP/TAZ knockdown-cellene sammenlignet med mus med kontrollceller når de telles manuelt. Den samme trenden ble observert ved bruk av bildeanalyseprogramvaren. Ikke bare dannet mange flere metastaser i kontrollmusene, men de var generelt større.
Konsekvent ble den metastatiske byrden i lungene også drastisk redusert ved YAP/TAZ-knockdown. Vellykket injeksjon av like mange friske celler i hver mus er avgjørende for å sikre data av høy kvalitet. Husk å være forsiktig og følg sikkerhetsretningslinjer når du arbeider med smittsomme retrovirus og lentivirus, spesielt hvis virusene er menneskelige smittsomme.
Denne teknikken har gjort det mulig for oss å illustrere rollene til kandidatgener og metastatisk kolonisering og vekst, noe som gir en måte å identifisere og teste nye terapeutiske mål for behandling av metastatisk sykdom. Etter denne prosedyren kan metastaser som inneholder lunger analyseres ytterligere ved immunofluorescent eller histologisk farging for å undersøke hvordan det endrede genet påvirker metastaser og identifisere andre proteiner som kan være involvert.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
