Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Immobilize Metal Affinity Kromatografisinde Metal Yıkamanın Ölçülmesi
Chapters
Summary January 17th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
İmmobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak hazırlanan numunelere tanıtılan metallerin kolay ölçülmesi için bir test salıyoruz. Yöntem, kolorimetrik metal göstergesi olarak hidroksinaphthol mavisi ve dedektör olarak UV-Vis spektrofotometresi kullanır.
Transcript
Yöntemimiz önemli, çünkü ortalama bir biyokimyacının immobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak izole edilen numunelerin geçiş metalleriyle kontamine olup olmadığını hızlı bir şekilde belirlemesine olanak sağlar. Ana avantajı, talın yapılabildiği kolaylıktır. Tahlil enstrümantasyon ve teknikleri en biyokimya laboratuvarları için ortak kullanır ve kolayca ve hızlı bir şekilde uygulanabilir.
Bu makalede nikel-NTA kolon ile izole edilmiş numuneler için bu yöntemi uygularken, yöntem başka bir metal afinite reçinesi ile kullanılabilir. İlk kez kullanıcılar bilinen konsantrasyon bir nikel stok çözümü ile bu yöntemi denemelisiniz. Bu, spektral değişikliklerde gösterilen iş akışı, örnek renkler ve reisinler hakkında onları tanıdık.
Prosedürü gösteren Cole Swain, laboratuvarımdan bir teknisyen. Başlamak için UV-Vis spektrofotometresini açın ve ısıtın. Proteini ölçmek için 280 nanometre optik absorbansiçeren diyot dizisi UV-Vis spektrofotometre kullanılarak teşbilenecek kromatografi fraksiyonlarını belirleyin.
Tris, HEPES, MOPS ve fosfat tamponu gibi PH'si 7 ile 12 arasında olan 10 ila 100 milimolar örnek tampon elde edin. Hazırlanan her mililitre lik stok çözeltisi için 120 miligram HNB reaktifi kullanarak numune arabelleğindeki HNB dağılımının hacim çözeltisi ile %12 ağırlık hazırlayın. Spektrofotometreyi 647 nanometrede veri toplamak için ayarlayın.
Spektrofotometreyi boşaltmak için örnek arabellekle dolu bir kuvars cuvette kullanın. Toplam elekt hacminin mililitrebaşına 50 mikrolitre HNB stoku içeren bir cuvette bir kontrol çözeltisi hazırlayın. Kontrol oda sıcaklığında en az üç dakika kuluçkaya izin verin.
Kontrol numunesi için emiciliği 647 nanometre de ölçün ve kaydedin. 150 mikrolitre HNB stoğunu, uygun seyreltilmiş protein fraksiyonlarının 2850 mikrolitresi ile numune tamponu ile karıştırarak test numunelerini hazırlayın. Numunenin oda sıcaklığında en az üç dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin.
Ölçülecek her kesir için spektrum kaydını tekrarlayın. Yeterli seyreltme elde edilmesi durumunda 647 nanometredeki spektral bandın tamamı yok edilir. Çok güçlü seyreltme ile olsa da, örnek kontrol ayırt edilemez.
Her numunedeki metal konsantrasyonunun belirlenmesi için, ilk olarak her numune emicisinin HNB kontrolünden 647 nanometrelik farkını bulun. DF'nin titrek fraksiyonu için seyreltme faktörü olduğu formülü kullanarak mikromolardaki metal konsantrasyonu belirleyin, delta A-B-S 647 647 nanometrede emici değişimdir, 3.65 çarpı 10 negatif 2 HNB'nin yok olma katsayısını temsil eder ve ben de cuvette'nin santimetrelik optik yoludur. Bu çalışmada, MSP1E3D1 izolasyonundan nikel iyon için titreşen fraksiyonların temsili spektrumlarında nötr PH'deki serbest HNB spektrumu burada gösterilmiştir.
HNB kontrolüne göre 647 nanometrede bir azalma emdirme gözlenmiştir, bu da bir geçiş metalinin varlığında HNB komplekslerinin oluşumuna karşılık gelmektedir. Bu testin uygulanmasını göstermek için, iki adet etiketli membran iskele proteini, MSP1E3D1, MSP2N2 ve geobacter sülfürden oluşan üç heme, c-tipi sitokrom GSU0105 adlı roman analiz edildi. GSU0105 için her fraksiyonun protein ve nikel iyon içeriği birbirinden önemli ölçüde kaydırılırken, en fazla proteini içeren MSP1E3D1 ve MSP2N2 kesirleri de en yüksek nikel içeriğine sahipti.
Ayrıca, metal içeriğinin harekete geçirilmiş metal afiyetkromatografisi kullanılarak toplanan kesirler arasında eşit olarak dağıtılmayabileceği de gösterilmiştir. Tüm örneklerdeki boşluğu yeterli ve tutarlı bir şekilde karıştırmak ve tüm numunelerde boş için eşit kuluçka sürelerine izin vermek en önemlidir. Metal kontaminasyonunu doğrulamak ve şelatlı veya güçlü bir şekilde bağlanmış protein metal iyonlarını test etmek için atomik absorpsiyon spektrometresi veya ICPMS ile özel ilgi protein fraksiyonları daha fazla analiz edilebilir.
Geçiş metal yıkama algılama yanı sıra, bu teknik proteinlere geçiş metal iyonları bağlayıcı yakınlıkları ölçmek için kullanılabilir. HNB ve numunelerde bulunan herhangi bir nikel sırasıyla göz ve cilt tahriş edicidir. Yöntem sırasında eldiven ve göz koruması içeren standart PPE kullanılmalıdır.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
