Visualisatie van macrofaag lytische celdood tijdens mycobacteriële infectie in zebravis-embryo's via Intravital microscopie

Dit protocol kan duidelijk onderscheid maken tussen macrofaagceldood tijdens mycobacteriële infectie. Door meerdere embryo’s parallel te observeren, vergroot het de kans op het vastleggen van het gehele macrofaagceldoodproces aanzienlijk. Dit protocol kan ook worden toegepast op de observatie van celdood en ander cellulair gedrag in vergelijkbare scenario’s met infectie of steriele ontsteking.

Tijdens de uitgebreide live beeldvorming is het erg belangrijk om de intensiteit van de laser zo laag mogelijk te houden om fotobleaching en toxiciteit te voorkomen. Na inenting volgens het manuscript, centrifuge de cultuur op 3000 keer G gedurende 10 minuten om de Mycobacterium marinum te verzamelen als een pellet. Gooi alle, maar 300 microliters van de supernatant, en opnieuw op te schorten de pellet.

Voeg drie milliliter 7H9 medium met 10%glycerol toe om de pellet verder op te schorten en vervolgens de suspensie in een waterbad op 100 watt te soniceren, met 15 seconden aan en 15 seconden uit, gedurende een totaal van twee minuten om een eencellig homogenaat te bereiken. Breng de bacteriële suspensie naar een 10 milliliter spuit, en ga door een vijf micron filter om eventuele bacteriële klonten te verwijderen. Met behulp van een spectrofotometer meet u de optische dichtheid van de ophanging en verdun deze met 7H9-media met 10%glycerol tot OD 600 bij één.

Verdeel de suspensie in 10 microliter aliquots, en bewaar op negatieve 80 graden Celsius vriezer voor verder gebruik. Verwarm eerst de agarose in een 95 graden Celsius verwarmingsblok totdat het volledig gesmolten is. Houd de agarose in vloeibare vorm door het in een 45 graden Celsius verwarmingsblok te plaatsen.

Om te monteren voor intramusculaire infectie in de stam regio, maak de onderste agarose laag door het gieten van 0,5 milliliter van 1%-gewicht in volume gelijkmatig op een glazen glijbaan. Plaats de glijbaan drie minuten op een koelbox of koud oppervlak om te stollen. Na het verdoven van de zebravis embryo’s, plaats tot 60 zebravis embryo’s op de bodem agarose laag, en leg ze zorgvuldig in twee rijen.

Verwijder het resterende water op de bodem agarose laag met tissue papier, voordat het toevoegen van 0,3 milliliter van 0,5%gewichts toe aan de bovenste laag te creëren. Zorg ervoor dat de embryo’s volledig zijn ingebed in de agarose. Breng de glazen schuif terug naar de ijskast om de agarose te stollen.

Houd de toplaag van de agarose vochtig door het oppervlak te bedekken met extra E3-eiwater. Pas vervolgens de microinjector en micromanipulator aan de juiste positie en instelling voor microinjectie. Breng drie microliter van voorbereide bacteriële cultuur in de voorbereide naald met behulp van een microloader.

Pipet langzaam en voorzichtig om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen. Injecteer 100 CFU in het koffergebied. Spoel na microinjectie de embryo’s van zebravissen voorzichtig door in zoet eiwater met een plastic pipet.

Om te monteren voor de midbrain infectie, gebruik maken van een plastic pipet om de vier tot zes tricaine-verdoofde embryo’s over te brengen in de agarose. Plaats het hoofd van elk embryo voorzichtig naar boven met een naald van 10 meter. Zodra alle embryo’s posities zijn vastgesteld, breng de glazen glijbaan naar een ijskast of koud oppervlak om de agarose te laten stollen.

Injecteer 500 CFU in het middenbrein. Spoel na microinjectie de embryo’s van zebravissen voorzichtig door in zoet eiwater met een plastic pipet. Zodra de agarose volledig gestold is, bedek de agarose met een laagje eiwater.

Na het opzetten van de milieukamer, plaats de 35 millimeter glazen bodem schotel met de zebravis in de milieukamer. Open de 405 diode, argon op 20% vermogen, en DPSS 561 nanometer laser. Stel de juiste laserkracht in in spectruminstellingen.

Kies de xyz-sequentiële scanacquisitiemodus en stel de indeling afbeeldingen in op 512 bij 512 pixels. Schakel over naar de live data-modus, target de positie van de eerste zebravis en markeer de begin- en eindpositie Z. Herhaal dit proces voor elk van de resterende embryo’s.

Voeg een pauze toe aan het einde van het programma. Definieer de lus en cyclus van het programma en sla het bestand op. In deze studie gebruikten we eerder gerapporteerde transgene coro1a:eGFP;lyzDsRed2 en transgene mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, om de macrofagen en de neutrofielen in vivo te onderscheiden.

Een macrofaag zwaar opgeslokt met bacteriën werd rond en weergegeven verminderde beweeglijkheid, met uiteindelijke cytoplasmatische zwelling, scheuren van het celmembraan, en snelle verspreiding van de cytoplasmatische inhoud. UV-bestraalde macrofagen toonden typische apoptotische cel fenotypes zoals celkrimp, nucleaire fragmentatie en chromatinecondensatie. Het werd ook waargenomen de macrofagen actief fagocytosed en verspreid M.merinum.

Echter, neutrofielen hadden beperkte fagocytische vermogen, en snel onderging lytische celdood zonder duidelijke bacteriële engorgement. In combinatie met krachtige genbewerkingstools kan dit protocol een effectief platform bieden om het effect van een verscheidenheid aan factoren op de interactie tussen gastheer en ziekteverwekker in vivo verder te begrijpen.