Cancer Research
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लक्ष्य एंटीजन विशिष्ट चिकित्सीय एंटीबॉडी के ट्यूमर और ऊतक वितरण का विश्लेषण
Chapters
Summary May 16th, 2020
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यहां हम चूहों ट्यूमर xenograft मॉडल में एंटीबॉडी के वीवो स्थानीयकरण में अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं।
Transcript
यह प्रोटोकॉल एंटीबॉडी की अभिव्यक्ति और शुद्धि और ट्यूमर और ऊतक में एंटीबॉडी वितरण की वास्तविक समय निगरानी को दर्शाता है। वर्णित प्रोटोकॉल के साथ एंटीबॉडी स्क्रीनिंग उन एंटीबॉडी का चयन करने में मदद करेगी जिनमें सीमित गैर-विशिष्ट ऊतक वितरण है, और ट्यूमर स्थानीयकरण को समृद्ध करते हैं। वर्णित तकनीक त्वरित और लागत प्रभावी है।
एकल फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी और पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी जैसी अन्य तकनीकें बहुत महंगी हैं और इसके लिए रेडियोधर्मी और अन्य परिष्कृत ट्रेसर की आवश्यकता होती है। यह तकनीक एंटीबॉडी को लक्षित करने वाले कैंसर तक ही सीमित नहीं है । यह शरीर में एंटीबॉडी वितरण के विश्लेषण के लिए फेफड़े या दिल की बीमारियों जैसे किसी अन्य बीमारी पर लागू किया जा सकता है।
प्रक्रिया का प्रदर्शन, जेरेमी गेट्समैन, मेरे विश्वविद्यालय से एक पशु चिकित्सा तकनीशियन होगा । मीडिया के २०० मिलीलीटर में कच्चे चो कोशिकाओं, Delong में, Erlenmeyer चकित flasks । 50 माइक्रोग्राम वेरिएबल हैवी क्लोन डीएनए के साथ चो फ्रीस्टाइल मीडिया के पांच मिलीलीटर, और 75 माइक्रोग्राम एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक चर प्रकाश क्लोन डीएनए मिलाएं।
इसके बाद ट्यूब को भंवर से उतारा। मिश्रण को कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए छोड़ दें। डीएनए समाधान में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पॉलीथीनमाइन स्टॉक के 750 माइक्रोलीटर जोड़ें, और आक्रामक रूप से इसे 30 सेकंड के लिए भंवर करें।
अतिरिक्त पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण छोड़ दें। चो कोशिकाओं में पूरे मिश्रण जोड़ें, जबकि मैन्युअल रूप से फ्लास्क मिलाते हुए। 130 आरपीएम पर मिलाते हुए तुरंत कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
अगले दिन, कोशिकाओं में 100 एक्स एंटी-क्लम्पिंग एजेंट के दो मिलीलीटर और 100 एक्स एंटीबैक्टीरियल एंटीमाइकोटिक समाधान के दो मिलीलीटर जोड़ें। १३० आरपीएम पर मिलाते हुए ३२ से ३४ डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें । 10 से 11 दिनों के लिए कोशिकाओं को खेती जारी रखें, ट्राइप्टोन एन1 फ़ीड के 10 मिलीलीटर और हर पांचवें दिन 100 एक्स ग्लूटामाइन पूरक के दो मिलीलीटर जोड़ें।
यह सुनिश्चित करने के लिए हर तीसरे दिन कोशिकाओं की गणना करें कि कोशिका व्यवहार्यता 10 या 11 दिन पर 80% से ऊपर बनी रहे, संस्कृति को 3000 बार जी पर अपकेंद्रित्र करके एंटीबॉडी शुद्धि के लिए माध्यम की कटाई करें, और 40 से 60 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस। फिर, 0.22 माइक्रोमीटर बोतल फिल्टर के साथ स्पष्ट मीडिया को फ़िल्टर करें। एंटीबॉडी को शुद्ध करने के लिए, प्रोटीन ए कॉलम को बाध्यकारी बफर के दो कॉलम वॉल्यूम के साथ बराबर करें।
प्रति मिनट एक मिलीलीटर की प्रवाह दर पर कॉलम के माध्यम से फ़िल्टर किए गए मीडिया को पास करें। फिर बाध्यकारी बफर के दो कॉलम वॉल्यूम के साथ कॉलम धोएं। एंटीबॉडी को 500 माइक्रोलीटर अंशों में एल्यूयूशन बफर के पांच मिलीलीटर का उपयोग करें।
और अंश के लिए बेअसर बफर के 10 माइक्रोलीटर जोड़कर इशारा एंटीबॉडी के पीएच बेअसर। आईजीजी के लिए डिफ़ॉल्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ शुद्ध एंटीबॉडी की एकाग्रता को मापें। एक लीटर कंजूगेशन बफर में डायलिसिस कैसेट का उपयोग करके एंटीबॉडी के 0.5 मिलीलीटर को डायलिज़ करें।
चार घंटे के बाद, डायलिसिस कैसेट को ताजा बफर में स्थानांतरित करें और रात भर डायलाइज करें। एक संयुग्म प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, 500 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में प्रति एक मिलीग्राम एंटीबॉडी आईआरआर डाई 800 सीडब्ल्यूयू के 0.03 माइक्रोग्राम जोड़ें। मिश्रण को 20 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, फिर पीबीएस के खिलाफ व्यापक डायलिसिस द्वारा लेबल किए गए संजूगेट को शुद्ध करें।
डाई 780 नैनोमीटर के अवशोषण को मापने, और 280 नैनोमीटर पर प्रोटीन के अवशोषण द्वारा लेबलिंग की डिग्री का अनुमान लगाएं। माउस ज़ेनाग्राफ विकसित करने के लिए, धीरे-धीरे जानवर की त्वचा को उठाएं और इसे अंतर्निहित मांसपेशियों की परत से अलग करें। धीरे-धीरे 26 गेज सुई के साथ त्वचा के नीचे सेल निलंबन के 100 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें।
सुई को बाहर निकालने से पहले कुछ सेकंड तक प्रतीक्षा करें ताकि बेसमेंट मैट्रिक्स माध्यम त्वचा के नीचे कोशिकाओं के साथ अर्ध-ठोस जेल जैसी संरचना को सूचित करे, जो मिश्रण को इंजेक्शन साइट से बाहर आने से रोकेगा। वीवो इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए, पूंछ नस के माध्यम से एंटीबॉडी लेबल डाई इंजेक्ट करें। माउस को एनेस्थेटाइज करने के बाद, पेडल सजगता के जवाब की कमी की जांच करें, और गर्म पानी लागू करके नस को फैलाएं।
100 माइक्रोलीटर की मात्रा में लेबल किए गए एंटीबॉडी के 25 माइक्रोग्राम इंजेक्ट करने के लिए 26 गेज सुई के साथ 1 सीसी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, लेबल और गैर विशिष्ट आईजीजी आइसोटाइप एंटीबॉडी जो कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित नहीं करता है सुई । एंटीबॉडी इंजेक्शन के आठ, 24 और 48 घंटे बाद वीवो इमेजिंग में प्रदर्शन करें।
इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, शुरुआत में क्लिक करें। इसकी पुष्टि करें कि स्टेज का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है। नियंत्रण कक्ष में, इमेजिंग जादूगर के माध्यम से फ्लोरेसेंस इमेजिंग की स्थापना की, और 773 नैनोमीटर, उत्सर्जन 792 नैनोमीटर के लिए उत्तेजना सेट करें।
एनेस्थेटाइज्ड माउस को इमेजिंग चैंबर में स्थानांतरित करें। नाक शंकु का उपयोग कर इमेजिंग क्षेत्र पर यह स्थिति। तैयार होने पर, छवि अधिग्रहण के लिए नियंत्रण कक्ष पर अधिग्रहण पर क्लिक करें, और ऑटो एक्सपोज पर क्लिक करें।
उत्पन्न छवि ऑप्टिकल फ्लोरेसेंस और गिनती या फोटॉनों की इकाइयों में प्रदर्शित घनत्व के साथ फोटोग्राफिक छवि पर फ्लोरेसेंस का ओवरले है। कॉलोनी पीसीआर के साथ वेरिएबल हैवी और वेरिएबल लाइट डोमेन के साथ पॉजिटिव सीडीएनए क्लोन की पुष्टि हुई । शुद्ध फरलेदुम्ब के प्रतिनिधि परिणाम यहां गैर-कम करने और एसडीएस पृष्ठ को कम करने पर चलते हैं।
हैवी और लाइट चेन में कमी के बाद 50 और 25 किलोडलटन बैंड का उत्पादन किया। कोशिका की सतह में देशी प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी के बाध्यकारी भी पुष्टि की गई थी । फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी पूंछ नस इंजेक्शन थे, चूहों में पूर्ण R1 ट्यूमर व्यक्त करने के साथ कलम ।
जानवरों को IVIS का उपयोग कर कई समय अंक पर छवि रहते थे । डेटा ट्यूमर में पूर्ण R1 और BaCa एंटीबॉडी के चयनात्मक संवर्धन confirs । इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, ध्यान रखें कि चो कोशिकाओं का आयोजित रखरखाव एंटीबॉडी उपज के लिए महत्वपूर्ण है।
और प्रतिस्पर्धी ट्यूमर स्थानीयकरण के लिए फ्लोरोसेंट डाई कंजूगेशन की एक समान डिग्री होना महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया के बाद, जीवित चूहों इमेजिंग डेटा का समर्थन करने के लिए ऊतक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और ऊतक या ट्यूमर विशिष्ट एलिसा जैसे अन्य तरीकों को किया जा सकता है।
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