Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Visualisering, kvantificering og kortlægning af immuncellepopulationer i tumormikromiljøet
Summary March 25th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi en enkel og tilgængelig strategi for visualisering, kvantificering og kortlægning af immunceller i formalin-faste paraffin-indlejrede tumorvævsektioner. Denne metode kombinerer eksisterende billedbehandlings- og digitale analyseteknikker med det formål at udvide multipleksingkapaciteten og multiparameteranalysen af billeddiagnostiske analyser.
Transcript
Den rumlige organisering af immuncellerne i tumormikromiljø har klinisk værdi. Denne strategi kan nemt bruges til at visualisere, kvantificere og kortlægge immunceller i tumorvæv. Immunterapi har revolutioneret kræftbehandling.
Men ikke alle patienter reagerer godt. Denne strategi kan tjene til at definere væv-immune signaturer, der kan forudsige en god anti-tumor respons. Før der udføres et eksperiment, testes antistofkombinationerne og strippingteknikkerne på kontrolvæv, og det kontrolleres, at AP'erne er korrekte til påvisning af interessemarkører.
Som skriftlige beskrivelser af billedanalyse metoder bruger sofistikeret teknisk sprog, kombinere tekst med video letter en bedre forståelse og replikering af metoden. For antigen hentning af formalin-faste, paraffin-indlejret tumorvæv sektioner, nedsænkes dewaxed vævsprøve i en Coplin krukke med antigen hentning løsning og placere krukken i en elektrisk trykkoger, der indeholder postevand. Vandstanden må ikke overstige halvdelen af glassets højde, så vandet ikke blandes med antigenudtagningsopløsningen.
Luk låget og trykventilen på komfuret og behandl rutsjebanerne med højt tryk i 10 minutter. Ved afslutningen af behandlingen skal du tage stikket ud af stikkontakten, slippe trykket og åbne låget. Når objektglassene er afkølet i komfuret i 30 minutter, vaskes prøverne to gange i fem minutter i frisk PBS pr. vask i en ny Coplin-krukke, og brug derefter en hydrofob pen til at tegne en barriere omkring hver vævssektion.
Dernæst nedsænkes rutsjebanerne i 0,1-molarglycin i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur, før du skyller objektglassene to gange i PBS som påvist. Efter den anden vask overføres objektglassene til et fugtighedskammer og dækker hver vævssektion med blokerende opløsning. Efter 30 minutter ved stuetemperatur skylles sektionerne to gange i fem minutter i frisk PBS-Tween pr. vask, hvorfra de primære relevante antistoffer, fortyndet i blokerende opløsning, til hvert dias, der er beskyttet mod lys.
Ved inkubationens afslutning skylles objektglassene tre gange i frisk PBS-Tween i fem minutter pr. vask, hvor sektionerne mærkes med de relevante sekundære antistoffer i en time ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning skylles objektglassene tre gange i frisk PBS-Tween i fem minutter pr. vask. Følg med en enkelt skylning i dobbeltdestilleret vand.
Fjern det overskydende vand fra hvert dias og montere væv med montering medium suppleret med DAPI og et dæksel dias. Efter at have presset det overskydende monteringsmedium ud, skal du lade objektglassene tørre i 20 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys, før du anskaffer billeder til alle kanaler ved hjælp af en helsinglescanner. Efter scanning skal du åbne billederne i billedanalysesoftwaren og klikke på fanen Vævsjustering.
Hvis du vil importere de billeder, der skal justeres i slidebakken, skal du vælge det første billede, der skal justeres fra databasen. Når alle billederne er indlæst, skal du klikke på Næste i trinnene Arbejdsproces for at sammenkæde billederne og trække og slippe alle de billeder, der skal justeres, til det første billede. Når alle billederne er blevet sammenkædet efter behov, skal du bruge mindst tre ben pr. billede, der angiver homologe vævsfunktioner i de sammenkædede billeder.
Brug en nål til at spore det første billede for at kontrollere kvaliteten af den resulterende justering. Hvis der er opnået en tilfredsstillende justering, skal du klikke på Næste for at få vist billedlagene og gemme det sammensatte billede i databasen. Hvis du vil udføre en vævsdetektering ved hjælp af den brugerdefinerede protokol APP 1, skal du åbne fanen Billedanalyse og åbne det sammensatte billede i billedanalysemodulet.
Klik på ikonet Åbn APP, og marker den relevante APP. Hvis du vil bekræfte, at APPEN fungerer, skal du gå til en valgt vævsplacering og klikke på Eksempel. Hvis resultaterne er tilfredsstillende, skal du klikke for at behandle billedet ved hjælp af den valgte APP.
Under behandlingen vil APP afgøre, om pixlen er forbundet med vævet for at tillade konvertering af alle vævsrelaterede pixel til et område af interesse. Den nyoprettede region af interesse kan derefter overføres til nogen af de justerede billeder. I slutningen af analysen skal du klikke på Filer og Gem for at gemme det ændrede billede med det nyoprettede interesseområde.
For segmentering af vævet i stroma og parenkym skal du åbne fanen Billedanalyse og vælge de filer af interesse fra databasen. Åben APP 2, APP 2 bruger PSR-farvede billede til væv segmentering. Eksempel på APP 2 ved at behandle billedet i et markeret synsfelt.
Hvis resultaterne er tilfredsstillende, skal du klikke på Kør for at behandle APP 2 på det fulde billede. Vævsregionen vil blive opdelt i stroma og parenkym, og deres respektive områder vil blive fastlagt. De nyoprettede regioner af interesse for stroma og parenkym kan overføres til de justerede billeder, derefter eksportere og gemme det ændrede billede som påvist.
Hvis du vil identificere og kvantificere cellepopulationer af interesse, skal du importere det segmenterede billede af interesse til billedanalysemodulet. Når du har justeret farven, skal du åbne APP 3. APP 3 vil detektere cellepopulationer af interesse og kvantificere dem inden for parenkym og stroma.
Hvis resultaterne er tilfredsstillende, skal du køre APP 3 på det fulde billede. Alle de enkelte celler af interesse vil blive mærket, deres væv koordinater gemt, og tætheden af celler af interesse i stroma og parenkymale regioner bestemmes. Det ændrede billede kan derefter gemmes som vist.
Hvis du vil udføre vævsoprulning af de interessecelleobjekter, skal du åbne den relevante brugerdefinerede protokol i app-valgvinduet og klikke på Kør for at bede APP'en om at bruge koordinaterne for de antistofmærkede objekter til at generere varmekortet. Hot spot områder, fremhævet med rødt, indeholder den højeste tæthed af celle befolkning af interesse, mens de mørkeblå områder har den laveste. Varmekortet over en bestemt cellepopulation kan overlejres på de justerede billeder for at give yderligere oplysninger om, hvordan disse celler er organiseret i tumormikromiljøet.
Derefter eksportere og gemme væv varme kort. Det er afgørende at kontrollere mærkningens specificitet, nøjagtigheden af de designede APPs og stripnings- og reprobingeffektiviteten af de forskellige pletter på samme sektion. Ved at integrere seriel billeddannelse, sekventiel mærkning og vævsjustering kan flere markører visualiseres samtidigt, og flere oplysninger kan udtrækkes fra begrænsede kliniske prøver.
H & E farvning af resected tumorvæv sektioner tillader evaluering af væv arkitektur, celle morfologi, og klinisk relevante parametre såsom typen af malignitet, tumor kvalitet, og samlede immun infiltration. CD34 farvning gør det muligt at detektionere endotelceller. Cytokeratin 8/18 farvning afslører tilstedeværelsen af epitelceller, og anti-alpha glat muskel actin farvning tillader identifikation af fibrogenic, aktiveret, hepatisk stellate celler.
Reprobing med antistoffer mod CD68 og Desmin tillader påvisning af makrofager og myofibroblaster henholdsvis. For bedre at karakterisere tumor-immune infiltrere, farvning for T-celle markører og myeloperoxidase kan udføres. Picro Sirius Rød farvning kan også udføres for at visualisere fibrillar kollagen og for at lette stroma og parenkym segmentering.
Vævsrelaterede pixel i de farvede sektioner kan identificeres for at muliggøre segmentering af forskellige rum inden for et bestemt område af interesse. De cellepopulationer af interesse kan derefter identificeres inden for hver region, så generering af vævskort, for hvilke regioner med høj tæthed for en given cellepopulation vises som hotspots og regioner med en relativt lav tæthed, vises som kolde pletter. Denne metode til identifikation, kvantificering og kortlægning af immunceller i vævsprøver kan tilpasses og valideres for specifikke forskningsspørgsmål og interessemarkør.
Denne strategi kan anvendes på væv mikro arrays for høj gennemløbsanalyse. Det kan også kombineres med in situ hybridisering til samtidig at undersøge in situ protein og genekspression. Vi har brugt denne strategi til at identificere og kortlægge IL-17A-producerende celler in situ i fibrotisk levervæv fra patienter.
Som angivet i protokollen er flere reagenser kemisk farlige, og de relevante procedurer bør udføres i en kemisk hætte ved hjælp af det relevante personlige beskyttelsesudstyr og forholdsregler.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
