Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Visualisatie, kwantificering en mapping van immuuncelpopulaties in de tumormicro-omgeving
Summary March 25th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier beschrijven we een eenvoudige en toegankelijke strategie voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in formaline-vaste paraffine-ingebedde tumorweefselsecties. Deze methodologie combineert bestaande beeldvormings- en digitale analysetechnieken met als doel de multiplexingcapaciteit en multiparameteranalyse van beeldvormingstesten uit te breiden.
Transcript
De ruimtelijke organisatie van de immuuncellen in de tumormicro-omgeving heeft klinische waarde. Deze strategie kan gemakkelijk worden gebruikt voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in tumorweefsel. Immunotherapie heeft een revolutie teweeggebracht in de behandeling van kanker.
Echter, niet alle patiënten reageren goed. Deze strategie kan dienen om de weefsel-immuun handtekeningen die een goede anti-tumor reactie kan voorspellen definiëren. Voordat u een experiment uitvoert, test u de antilichaamcombinaties en striptechnieken op controleweefsels en controleert u of de APP's nauwkeurig zijn in hun detectie van merkers van belang.
Aangezien geschreven beschrijvingen van beeldanalysemethoden geavanceerde technische taal gebruiken, vergemakkelijkt het combineren van tekst met video een beter begrip en replicatie van de methodologie. Voor het ophalen van formaline vaste, paraffine-ingebedde tumorweefselsecties, dompel het ontwaxte weefselmonster onder in een Coplin-pot met antigeenophaaloplossing en plaats u de pot in een elektrische snelkookpan met kraanwater. Het waterniveau mag niet hoger zijn dan de helft van de hoogte van de pot, zodat het water niet mengt met de antigeen retrieval oplossing.
Sluit het deksel en de drukklep op het fornuis en behandel de glijbanen 10 minuten onder hoge druk. Aan het einde van de behandeling trekt u de stekker uit het fornuis, laat u de druk los en opent u het deksel. Nadat de glijbanen 30 minuten in het fornuis zijn afgekoeld, was je de monsters twee keer vijf minuten in verse PBS per wasbeurt in een nieuwe Coplin-pot en gebruik dan een hydrofobe pen om een barrière rond elke weefselsectie te tekenen.
Vervolgens dompel de glijbanen in 0,1-molaire glycine in PBS gedurende 15 minuten op kamertemperatuur voordat u de glijbanen twee keer in PBS spoelt, zoals aangetoond. Breng na de tweede wasbeurt de glijbanen over in een vochtigheidskamer en bedek elke weefselsectie met blokkeringsoplossing. Na 30 minuten bij kamertemperatuur, spoel de secties twee keer gedurende vijf minuten in verse PBS-Tween per wasbeurt voeg dan de primaire antilichamen van belang, verdund in het blokkeren van oplossing, aan elke dia, beschermd tegen licht.
Spoel de glijbanen aan het einde van de incubatie drie maal in verse PBS-Tween gedurende vijf minuten per wasbeurt af en label de secties vervolgens gedurende een uur bij kamertemperatuur met de juiste secundaire antilichamen. Spoel de glijbanen aan het einde van de incubatie drie maal in verse PBS-Tween gedurende vijf minuten per wasbeurt. Volg met een enkele spoeling in dubbel gedestilleerd water.
Verwijder het overtollige water van elke glijbaan en monteer de weefsels met montagemedium aangevuld met DAPI en een afdekplaat. Na het uitknijpen van het overtollige montagemedium, laat de dia's 20 minuten drogen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, voordat u beelden voor alle kanalen verwerft met behulp van een hele diascanner. Open na het scannen de afbeeldingen in de software voor beeldanalyse en klik op het tabblad Tissuealign.
Als u de afbeeldingen wilt importeren die in de dialade moeten worden uitgelijnd, selecteert u de eerste afbeelding die uit de database moet worden uitgelijnd. Wanneer alle afbeeldingen zijn geladen, klikt u op Volgende in de werkstroomstappen om de afbeeldingen te koppelen en alle afbeeldingen die op de eerste afbeelding moeten worden uitgelijnd, te slepen en neer te zetten. Wanneer alle afbeeldingen zijn gekoppeld, gebruik maken van een minimum van drie pinnen per afbeelding met vermelding van homologe weefsel functies in de gekoppelde beelden.
Gebruik een pin om de eerste afbeelding te traceren om de kwaliteit van de resulterende uitlijning te controleren. Als er een bevredigende uitlijning is verkregen, klikt u op Volgende om de afbeeldingslagen weer te geven en de samengestelde afbeelding in de database op te slaan. Als u een weefseldetectie wilt uitvoeren met het door de gebruiker gedefinieerde protocol APP 1, opent u het tabblad Afbeeldingsanalyse en opent u de samengestelde afbeelding in de beeldanalysemodule.
Klik op het pictogram APP openen en selecteer de juiste APP. Als u wilt bevestigen dat de APP werkt, gaat u naar een geselecteerde weefsellocatie en klikt u op Voorbeeld. Als de resultaten bevredigend zijn, klikt u om de afbeelding te verwerken met de geselecteerde APP.
Tijdens de verwerking zal de APP bepalen of de pixel is gekoppeld aan het weefsel om conversie van alle weefsel-geassocieerde pixels in een gebied van belang. Het nieuw gecreëerde interessegebied kan vervolgens worden overgedragen naar een van de uitgelijnde afbeeldingen. Klik aan het einde van de analyse op Bestand en Opslaan om de gewijzigde afbeelding op te slaan met het nieuw gemaakte interessegebied.
Open voor segmentatie van het weefsel in stroma en parenchyma het tabblad Beeldanalyse en selecteer de bestanden van belang uit de database. Open APP 2, APP 2 gebruikt de PSR-gekleurde afbeelding voor weefselsegmentatie. Een voorbeeld van APP 2 door de afbeelding in een geselecteerd weergaveveld te verwerken.
Als de resultaten bevredigend zijn, klikt u op Uitvoeren om APP 2 op de volledige afbeelding te verwerken. Het gebied van belang van het weefsel zal worden gesegmenteerd in stroma en parenchyma en hun respectieve gebieden bepaald. De nieuw gecreëerde regio's van belang voor de stroma en parenchyma kunnen worden overgebracht naar de uitgelijnde beelden, vervolgens exporteren en opslaan van de gewijzigde afbeelding zoals aangetoond.
Als u celpopulaties van belang wilt identificeren en kwantificeren, importeert u het gesegmenteerde beeld van belang in de module beeldanalyse. Nadat u de kleur hebt aangepast, opent u APP 3. APP 3 detecteert de celpopulaties van belang en kwantificeert ze binnen de parenchyma en de stroma.
Als de resultaten bevredigend zijn, voert u APP 3 uit op de volledige afbeelding. Alle afzonderlijke cellen van belang zullen worden gelabeld, hun weefselcoördinaten opgeslagen, en de dichtheden van de cellen van belang in de stroma en parenchymale regio's bepaald. De gewijzigde afbeelding kan vervolgens worden opgeslagen zoals aangetoond.
Als u weefselverwarming van de met het label van de cel van belang gelabelde objecten wilt uitvoeren, opent u het juiste door de gebruiker gedefinieerde protocol in het app-selectievenster en klikt u op Uitvoeren om de APP te vragen de coördinaten van de objecten met het antilichaam te gebruiken om de warmtekaart te genereren. Hot spot gebieden, gemarkeerd in rood, bevatten de hoogste dichtheid van de cel populatie van belang, terwijl de donkerblauwe gebieden hebben de laagste. De warmtekaart van een specifieke celpopulatie kan worden op elkaar geplaatst op de uitgelijnde beelden om aanvullende informatie te geven over hoe deze cellen binnen de tumormicro-omgeving zijn georganiseerd.
Dan exporteren en opslaan van het weefsel warmtekaart. Het is van cruciaal belang om de specificiteit van de etikettering te verifiëren, de nauwkeurigheid van de ontworpen APPs, en de strippen en reprobing efficiëntie van de verschillende vlekken op dezelfde sectie. Door seriële beeldvorming, sequentiële etikettering en weefseluitlijning te integreren, kunnen meer markers tegelijkertijd worden gevisualiseerd en kan meer informatie worden geëxtraheerd uit beperkte klinische specimens.
H&E kleuring van resected tumor weefsel secties maakt evaluatie van de weefselarchitectuur, celmorfologie, en klinisch relevante parameters zoals het type maligniteit, tumor rang, en de algehele immuuninfiltratie. CD34-vlekken maken de detectie van endotheelcellen mogelijk. Cytokeratine 8/18 vlekken onthult de aanwezigheid van epitheelcellen, en anti-alfa gladde spier actin kleuring maakt de identificatie van fibrogene, geactiveerde, hepatische stellate cellen.
Reprobing met antilichamen tegen CD68 en Desmin maken de detectie van respectievelijk macrofagen en myofibroblasten mogelijk. Om de tumor-immuuninfiltreren beter te karakteriseren, kan vlekken voor T-celmarkers en myeloperoxidase worden uitgevoerd. Picro Sirius Rode kleuring kan ook worden uitgevoerd om fibrillar collageen te visualiseren en stroma en parenchyma segmentatie te vergemakkelijken.
Weefsel-geassocieerde pixels binnen de gekleurde secties kunnen worden geïdentificeerd om de segmentatie van verschillende compartimenten binnen een bepaald gebied van belang mogelijk te maken. De celpopulaties van belang kunnen dan binnen elke regio worden geïdentificeerd, waardoor het genereren van weefselkaarten waarvoor regio's met een hoge dichtheid voor een bepaalde celpopulatie worden weergegeven als hotspots en regio's met een relatief lage dichtheid als koude plekken worden weergegeven. Deze methode voor het identificeren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in weefselmonsters kan worden aangepast aan en gevalideerd voor een specifieke onderzoeksvraag en merker van belang.
Deze strategie kan worden toegepast op weefselmicroarrays voor een hoge doorvoeranalyse. Het kan ook worden gecombineerd met in situ hybridisatie om tegelijkertijd te onderzoeken in situ eiwit en genexpressie. We hebben deze strategie gebruikt om IL-17A-producerende cellen in situ in fibrotisch leverweefsel van patiënten te identificeren en in kaart te brengen.
Zoals aangegeven in het protocol, zijn verschillende reagentia chemisch gevaarlijk en moeten de relevante procedures in een chemische kap worden uitgevoerd met behulp van de juiste persoonlijke beschermende kleding en voorzorgsmaatregelen.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
