Immunology and Infection
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ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में रोग, परिमाणीकरण और प्रतिरक्षा सेल आबादी का मानचित्रण
Summary March 25th, 2020
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यहां, हम फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ट्यूमर ऊतक वर्गों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कल्पना, मात्रा और मानचित्रण के लिए एक सरल और सुलभ रणनीति का वर्णन करते हैं। यह पद्धति मौजूदा इमेजिंग और डिजिटल विश्लेषण तकनीकों को मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता और इमेजिंग परखों के बहुमापदंडीय विश्लेषण के विस्तार के उद्देश्य से जोड़ती है।
Transcript
ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानिक संगठन का नैदानिक मूल्य होता है। इस रणनीति का उपयोग ट्यूमर ऊतक के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कल्पना, मात्रा और मानचित्रण के लिए आसानी से किया जा सकता है। इम्यूनोथेरेपी ने कैंसर के इलाज में क्रांति ला दी है।
हालांकि, सभी रोगियों को अच्छी तरह से प्रतिक्रिया नहीं है । यह रणनीति ऊतक-प्रतिरक्षा हस्ताक्षरों को परिभाषित करने की सेवा कर सकती है जो एक अच्छे एंटी-ट्यूमर प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी कर सकते हैं। एक प्रयोग आयोजित करने से पहले, नियंत्रण ऊतकों पर एंटीबॉडी संयोजन और स्ट्रिपिंग तकनीकों का परीक्षण करें और सत्यापित करें कि एपीपी ब्याज के मार्कर का पता लगाने में सटीक हैं।
छवि विश्लेषण विधियों के लिखित विवरण के रूप में परिष्कृत तकनीकी भाषा का उपयोग करते हैं, वीडियो के साथ पाठ के संयोजन से कार्यप्रणाली की बेहतर समझ और प्रतिकृति की सुविधा होती है। फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड ट्यूमर ऊतक अनुभागों के एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए, एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान के कोप्लिन जार में डेवक्स्ड ऊतक नमूने को विसर्जित करें और जार को नल के पानी वाले इलेक्ट्रिक प्रेशर कुकर में रखें। जल स्तर जार की ऊंचाई के आधे से अधिक नहीं होना चाहिए ताकि पानी एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान के साथ न मिलाएं।
कुकर पर ढक्कन और प्रेशर वाल्व बंद करें और स्लाइड्स को 10 मिनट तक हाई प्रेशर से ट्रीट करें। उपचार के अंत में, कुकर को अनप्लग करें, दबाव छोड़ें, और ढक्कन खोलें। स्लाइड्स के बाद कुकर में 30 मिनट के लिए ठंडा हो गया है, एक नए Coplin जार में धोने प्रति धोने ताजा PBS में पांच मिनट के लिए दो बार नमूनों को धोने, तो एक हाइड्रोफोबिक कलम का उपयोग करने के लिए प्रत्येक ऊतक अनुभाग के आसपास एक बाधा आकर्षित ।
आगे की स्लाइड्स में 0.1-मोलर ग्लाइसिन को पीबीएस में 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डुबोएं पीबीएस में दो बार स्लीव्स को रिंस करने से पहले... दूसरे धोने के बाद, स्लाइड को आर्द्रता कक्ष में स्थानांतरित करें और प्रत्येक ऊतक अनुभाग को अवरुद्ध समाधान के साथ कवर करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के बाद, ताजा PBS-Tween प्रति धोने में पांच मिनट के लिए दो बार वर्गों कुल्ला तो ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें, समाधान अवरुद्ध में पतला, प्रत्येक स्लाइड के लिए, प्रकाश से संरक्षित ।
इनक्यूबेशन के अंत में, ताजा PBS-Tween में धोने के प्रति पांच मिनट के लिए तीन बार स्लाइड कुल्ला, तो कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों लेबल । इनक्यूबेशन के अंत में, पांच मिनट प्रति धोने के लिए ताजा PBS-ट्वीन में तीन बार स्लाइड कुल्ला । डबल-डिस्टिल्ड पानी में एक ही कुल्ला के साथ पालन करें।
प्रत्येक स्लाइड से अतिरिक्त पानी निकालें और दापी और एक कवर स्लाइड के साथ पूरक बढ़ते मध्यम के साथ ऊतकों माउंट। अतिरिक्त बढ़ते माध्यम को निचोड़ने के बाद, स्लाइड को पूरे स्लाइड स्कैनर का उपयोग करके सभी चैनलों के लिए छवियों को प्राप्त करने से पहले, प्रकाश से संरक्षित, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सूखने दें। स्कैनिंग के बाद इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर में इमेज खोलें और टिशूलाइन टैब पर क्लिक करें।
स्लाइड ट्रे में गठबंधन करने के लिए छवियों को आयात करने के लिए, डेटाबेस से गठबंधन करने के लिए पहली छवि का चयन करें। जब सभी छवियों को लोड कर लिया गया है, तो छवियों को लिंक करने और पहली छवि पर गठबंधन करने के लिए सभी छवियों को खींचने और छोड़ने के लिए कार्यप्रवाह चरणों में नेक्स्ट पर क्लिक करें। जब सभी छवियों को उपयुक्त के रूप में जोड़ा गया हो, तो लिंक की गई छवियों में समरूप ऊतक सुविधाओं का संकेत देने वाली प्रति छवि न्यूनतम तीन पिनों का उपयोग करें।
परिणामस्वरूप संरेखण की गुणवत्ता की जांच करने के लिए पहली छवि का पता लगाने के लिए एक पिन का उपयोग करें। यदि एक संतोषजनक संरेखण प्राप्त किया गया है, तो छवि परतों को देखने और डेटाबेस में समग्र छवि को बचाने के लिए आगे क्लिक करें। उपयोगकर्ता-परिभाषित प्रोटोकॉल ऐप 1 का उपयोग करके ऊतक का पता लगाने के लिए, इमेज एनालिसिस टैब खोलें और इमेज एनालिसिस मॉड्यूल में समग्र छवि खोलें।
ओपन ऐप आइकन पर क्लिक करें और उपयुक्त ऐप का चयन करें। यह पुष्टि करने के लिए कि ऐप काम कर रहा है, एक चयनित ऊतक स्थान पर नेविगेट करें और पूर्वावलोकन पर क्लिक करें। यदि परिणाम संतोषजनक हैं, तो चयनित ऐप का उपयोग करके छवि को संसाधित करने के लिए क्लिक करें।
प्रसंस्करण के दौरान ऐप यह निर्धारित करेगा कि पिक्सेल ऊतक से जुड़ा हुआ है या नहीं, ऊतक से जुड़े सभी पिक्सेल को ब्याज के क्षेत्र में बदलने की अनुमति देने के लिए। ब्याज के नवनिर्मित क्षेत्र को फिर किसी भी गठबंधन छवियों को स्थानांतरित किया जा सकता है। विश्लेषण के अंत में, ब्याज के नवनिर्मित क्षेत्र के साथ संशोधित छवि को बचाने के लिए फ़ाइल पर क्लिक करें और सहेजें।
ऊतक को स्ट्रोमा और पैरान्चिमा में विभाजित करने के लिए, इमेज एनालिसिस टैब खोलें और डेटाबेस से ब्याज की फाइलों का चयन करें। ओपन ऐप 2, ऐप 2 ऊतक विभाजन के लिए पीएसआर-दाग छवि का उपयोग करता है। देखने के चयनित क्षेत्र में छवि को संसाधित करके ऐप 2 का पूर्वावलोकन करें।
यदि परिणाम संतोषजनक हैं, तो पूर्ण छवि पर ऐप 2 को संसाधित करने के लिए रन पर क्लिक करें। ऊतक के हित के क्षेत्र को स्ट्रोमा और परेंचिमा और उनके संबंधित क्षेत्रों में विभाजित किया जाएगा। स्ट्रोमा और परेंचिमा के लिए ब्याज के नवनिर्मित क्षेत्रों को गठबंधन छवियों को स्थानांतरित किया जा सकता है, फिर प्रदर्शन के अनुसार संशोधित छवि को निर्यात और सहेजें।
ब्याज की सेल आबादी की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए, छवि विश्लेषण मॉड्यूल में ब्याज की खंडित छवि आयात करें। रंग को समायोजित करने के बाद, ऐप 3 खोलें। एपीपी 3 ब्याज की सेल आबादी का पता लगाएगा और उन्हें परेंचिमा और स्ट्रोमा के भीतर मात्रा देगा।
यदि परिणाम संतोषजनक हैं, तो पूरी छवि पर ऐप 3 चलाएं। ब्याज की सभी व्यक्तिगत कोशिकाओं को लेबल किया जाएगा, उनके ऊतक संग्रहीत निर्देशांक, और स्ट्रोमा और पैरान्चिमल क्षेत्रों में रुचि की कोशिकाओं के घनत्व निर्धारित किए गए हैं। संशोधित छवि तो प्रदर्शन के रूप में बचाया जा सकता है ।
सेल-ऑफ-इंटरेस्ट लेबल वाली वस्तुओं के ऊतक हीटमैपिंग करने के लिए, ऐप चयन विंडो में उपयुक्त उपयोगकर्ता-परिभाषित प्रोटोकॉल खोलें और ऐप को हीट मैप उत्पन्न करने के लिए एंटीबॉडी-लेबल वस्तुओं के निर्देशांक का उपयोग करने के लिए प्रेरित करने के लिए रन पर क्लिक करें। हॉट स्पॉट क्षेत्रों, लाल रंग में प्रकाश डाला, ब्याज की सेल आबादी के उच्चतम घनत्व होते हैं, जबकि गहरे नीले क्षेत्रों में सबसे कम है । एक विशिष्ट कोशिका आबादी का गर्मी नक्शा गठबंधन छवियों पर आरोपित किया जा सकता है कि कैसे इन कोशिकाओं ट्यूमर microenvironment के भीतर आयोजित कर रहे है के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करते हैं ।
फिर निर्यात और ऊतक गर्मी नक्शा बचाने के लिए। लेबलिंग की विशिष्टता, डिज़ाइन किए गए एपीपी की सटीकता और एक ही खंड पर विभिन्न दागों की स्ट्रिपिंग और रीप्रोबिंग दक्षता को सत्यापित करना महत्वपूर्ण है। धारावाहिक इमेजिंग, अनुक्रमिक लेबलिंग, और ऊतक संरेखण को एकीकृत करके, अधिक मार्कर को एक साथ कल्पना की जा सकती है और सीमित नैदानिक नमूनों से अधिक जानकारी निकाली जा सकती है।
एच एंड ई पुनः प्राप्त ट्यूमर ऊतक वर्गों के धुंधला ऊतक वास्तुकला, सेल आकृति विज्ञान, और चिकित्सकीय प्रासंगिक मापदंडों जैसे द्रोह के प्रकार, ट्यूमर ग्रेड, और समग्र प्रतिरक्षा घुसपैठ के मूल्यांकन की अनुमति देता है। CD34 धुंधला एंडोथेलियल कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देता है। साइटोकेराटिन 8/18 धुंधला एपिथेलियल कोशिकाओं की उपस्थिति का पता चलता है, और एंटी-अल्फा चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन धुंधला फाइब्रोजेनिक, सक्रिय, हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है।
CD68 और डेसमिन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ पुनर्प्राण क्रमशः मैक्रोफेज और माइफिब्रोब्लास्ट का पता लगाने की अनुमति देते हैं। बेहतर ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ की विशेषता के लिए, टी सेल मार्कर और myeloperoxidase के लिए धुंधला प्रदर्शन किया जा सकता है । पिरो सीरियस रेड स्टेनिंग को फिब्रिलर कोलेजन की कल्पना करने और स्ट्रोमा और पैरान्चिमा सेगमेंटेशन की सुविधा के लिए भी किया जा सकता है।
दाग वाले खंडों के भीतर ऊतक से जुड़े पिक्सेल की पहचान की जा सकती है ताकि ब्याज के एक विशिष्ट क्षेत्र के भीतर विभिन्न डिब्बों के विभाजन की अनुमति दी जा सके। ब्याज की कोशिका आबादी तो प्रत्येक क्षेत्र के भीतर की पहचान की जा सकती है, ऊतक नक्शे की पीढ़ी की अनुमति है जिसके लिए एक दिया सेल आबादी के लिए उच्च घनत्व के क्षेत्रों हॉट स्पॉट और एक अपेक्षाकृत कम घनत्व के साथ क्षेत्रों के रूप में प्रदर्शित कर रहे है ठंडे धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं । ऊतक के नमूनों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान, मात्रा और मानचित्रण के लिए इस पद्धति को एक विशिष्ट शोध प्रश्नों और रुचि के मार्कर के लिए अनुकूलित और मान्य किया जा सकता है।
इस रणनीति को उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए ऊतक माइक्रो सरणी पर लागू किया जा सकता है। यह भी सीटू संकरण में एक साथ सीटू प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति में जांच करने के साथ जोड़ा जा सकता है । हमने रोगियों से फाइब्रोटिक लिवर ऊतक में सीटू में आईएल-17A-उत्पादक कोशिकाओं की पहचान करने और मानचित्रण करने के लिए इस रणनीति का उपयोग किया है।
जैसा कि प्रोटोकॉल में दर्शाया गया है, कई अभिकर् तार रासायनिक रूप से खतरनाक हैं और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक गियर और सावधानियों का उपयोग करके रासायनिक हुड में प्रासंगिक प्रक्रियाएं की जानी चाहिए।
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