Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Visualisering, kvantifisering og kartlegging av immuncellepopulasjoner i tumormikromiljøet
Summary March 25th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi en enkel og tilgjengelig strategi for visualisering, kvantifisering og kartlegging av immunceller i formalin-faste parafin-innebygde tumorvevseksjoner. Denne metoden kombinerer eksisterende bilde- og digitale analyseteknikker med det formål å utvide multipleksjonsevnen og multiparameteranalysen av bildebehandlingsanalyser.
Transcript
Den romlige organiseringen av immuncellene i tumormikromiljøet har klinisk verdi. Denne strategien kan enkelt brukes til å visualisere, kvantifisere og kartlegge immunceller i tumorvev. Immunterapi har revolusjonert kreftbehandling.
Men ikke alle pasienter reagerer godt. Denne strategien kan tjene til å definere vev-immun signaturer som kan forutsi en god anti-tumor respons. Før du utfører et eksperiment, test antistoffkombinasjoner og stripping teknikker på kontroll vev og kontrollere at APPs er nøyaktig i deres påvisning av markører av interesse.
Som skriftlige beskrivelser av bildeanalyse metoder bruker sofistikert teknisk språk, kombinere tekst med video forenkler en bedre forståelse og replikering av metodikken. For antigenhenting av formalin-faste, parafin-innebygde tumorvevsseksjoner, senk den avvoksede vevsprøven i en Coplin-krukke med antigenhentingsløsning og legg krukken i en elektrisk trykkoker som inneholder vann fra springen. Vannstanden bør ikke overstige halvparten av høyden på krukken slik at vannet ikke blandes med antigenhentingsløsningen.
Lukk lokket og trykkventilen på komfyren og behandle lysbildene med høyt trykk i 10 minutter. På slutten av behandlingen, koble fra komfyren, slipp trykket og åpne lokket. Etter at lysbildene er avkjølt i komfyren i 30 minutter, vask prøvene to ganger i fem minutter i fersk PBS per vask i en ny Coplin-krukke, og bruk deretter en hydrofob penn til å tegne en barriere rundt hver vevseksjon.
Deretter senker du lysbildene i 0,1-molar glycin i PBS i 15 minutter ved romtemperatur før du skyller lysbildene to ganger i PBS som demonstrert. Etter den andre vasken, overfør lysbildene til et fuktighetskammer og dekk hver vevseksjon med blokkeringsløsning. Etter 30 minutter ved romtemperatur, skyll seksjonene to ganger i fem minutter i frisk PBS-Tween per vask og legg deretter til de primære antistoffene av interesse, fortynnet i blokkerende løsning, til hvert lysbilde, beskyttet mot lys.
På slutten av inkubasjonen, skyll lysbildene tre ganger i frisk PBS-Tween i fem minutter per vask, og merk deretter seksjonene med de riktige sekundære antistoffene i en time ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, skyll lysbildene tre ganger i frisk PBS-Tween i fem minutter per vask. Følg med en enkelt skyll i dobbeltdestillert vann.
Fjern overflødig vann fra hver sklie og monter vevet med monteringsmediet supplert med DAPI og et dekselsklie. Etter å ha klemt ut det overskytende monteringsmediet, la lysbildene tørke i 20 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys, før du anskaffer bilder for alle kanalene ved hjelp av en helskysskanner. Etter skanning åpner du bildene i bildeanalyseprogramvaren og klikker kategorien Tissuealign.
Hvis du vil importere bildene som skal justeres inn i lysbildeskuffen, velger du det første bildet som skal justeres fra databasen. Når alle bildene er lastet inn, klikker du Neste i arbeidsflyttrinnene for å koble bildene og dra og slippe alle bildene som skal justeres på det første bildet. Når alle bildene er koblet sammen etter behov, bruker du minst tre pinner per bilde som indikerer homologe vevsfunksjoner i de koblede bildene.
Bruk en stift til å spore det første bildet for å kontrollere kvaliteten på den resulterende justeringen. Hvis en tilfredsstillende justering er oppnådd, klikker du Neste for å vise bildelagene og lagre det sammensatte bildet i databasen. Hvis du vil utføre en vevsgjenkjenning ved hjelp av den brukerdefinerte protokollen APP 1, åpner du kategorien Bildeanalyse og åpner det sammensatte bildet i bildeanalysemodulen.
Klikk på Åpne APP-ikonet, og velg den aktuelle APPEN. Hvis du vil bekrefte at APPEN fungerer, navigerer du til et valgt vevssted og klikker forhåndsvisning. Hvis resultatene er tilfredsstillende, klikker du for å behandle bildet ved hjelp av den valgte APPEN.
Under behandlingen avgjør APPEN om pikselen er knyttet til vevet for å tillate konvertering av alle vevsrelaterte piksler til et interesseområde. Det nyopprettede interesseområdet kan deretter overføres til et hvilket som helst av de justerte bildene. Klikk Fil og lagre på slutten av analysen for å lagre det endrede bildet med det nylig opprettede interesseområdet.
For segmentering av vevet i stroma og parenchyma, åpne kategorien Bildeanalyse og velg interessefiler fra databasen. Åpne APP 2, APP 2 bruker det PSR-farget bilde for vevsegmentering. Forhåndsvis APP 2 ved å behandle bildet i et valgt synsfelt.
Hvis resultatene er tilfredsstillende, klikker du Kjør for å behandle APP 2 på hele bildet. Regionen av interesse for vevet vil bli segmentert i stroma og parenchyma og deres respektive områder bestemt. De nyopprettede områdene av interesse for stroma og parenchyma kan overføres til de justerte bildene, og deretter eksportere og lagre det modifiserte bildet som demonstrert.
Hvis du vil identifisere og kvantifisere cellepopulasjoner av interesse, importerer du det segmenterte bildet av interesse til bildeanalysemodulen. Når du har justert fargen, åpner du APP 3. APP 3 vil oppdage cellepopulasjonene av interesse og kvantifisere dem i parenchyma og stroma.
Hvis resultatene er tilfredsstillende, kjører du APP 3 på hele bildet. Alle de enkelte cellene av interesse vil bli merket, deres vevkoordinater lagret, og tetthetene til cellene av interesse i stroma og parenchymale regioner bestemmes. Det endrede bildet kan deretter lagres som demonstrert.
Hvis du vil utføre vevsvarmekart av de interessecellemerkede objektene, åpner du den aktuelle brukerdefinerte protokollen i appvalgvinduet og klikker Kjør for å be APP om å bruke koordinatene til de antistoffmerkede objektene til å generere varmekartet. Hot spot områder, uthevet i rødt, inneholder den høyeste tettheten av cellepopulasjonen av interesse mens de mørkeblå områdene har lavest. Varmekartet over en bestemt cellepopulasjon kan legges over på de justerte bildene for å gi ytterligere informasjon om hvordan disse cellene er organisert i tumormikromiljøet.
Deretter eksportere og lagre vev varme kartet. Det er avgjørende å verifisere spesifisiteten til merkingen, nøyaktigheten av de utformede APPene, og stripping og reprobing effektivitet av de forskjellige flekker på samme seksjon. Ved å integrere serielavbildning, sekvensiell merking og vevsjustering kan flere markører visualiseres samtidig, og mer informasjon kan ekstraheres fra begrensede kliniske prøver.
H&E farging av resected tumor vev seksjoner tillater evaluering av vev arkitektur, celle morfologi, og klinisk relevante parametere som type malignitet, tumor karakter, og generell immun infiltrasjon. CD34-farging gjør det mulig å oppdage endotelceller. Cytokeratin 8/18 farging avslører tilstedeværelsen av epitelceller, og anti-alfa glatt muskel actin farging tillater identifisering av fibrogene, aktiverte, lever stellate celler.
Reprobing med antistoffer mot CD68 og Desmin tillate påvisning av makrofager og myofibroblaster henholdsvis. For bedre å karakterisere tumor-immun infiltrat, kan farging for T-cellemarkører og myeloperoxidase utføres. Picro Sirius Rød farging kan også utføres for å visualisere fibrillar kollagen og for å lette stroma og parenchyma segmentering.
Vevsrelaterte piksler innenfor de beisede delene kan identifiseres for å tillate segmentering av forskjellige rom innenfor et bestemt interesseområde. Cellepopulasjonene av interesse kan deretter identifiseres i hver region, slik at generering av vevskart som områder med høy tetthet for en gitt cellepopulasjon vises som hot spots og regioner med relativt lav tetthet vises som kalde flekker. Denne metodikken for å identifisere, kvantifisere og kartlegge immunceller i vevsprøver kan tilpasses og valideres for et bestemt forskningsspørsmål og markør av interesse.
Denne strategien kan brukes på vev mikro arrays for høy gjennomstrømning analyse. Det kan også kombineres med in situ hybridisering for å samtidig undersøke in situ protein og genuttrykk. Vi har brukt denne strategien til å identifisere og kartlegge IL-17A-produserende celler in situ i fibrotisk levervev fra pasienter.
Som angitt i protokollen, er flere reagenser kjemisk farlige, og de relevante prosedyrene skal utføres i en kjemisk hette ved hjelp av passende personlig verneutstyr og forholdsregler.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
