Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Visualisering, kvantifiering och kartläggning av immuncellpopulationer i tumörmikromiljön
Summary March 25th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här beskriver vi en enkel och tillgänglig strategi för visualisering, kvantifiering och kartläggning av immunceller i formalin-fast paraffin-inbäddade tumör vävnad sektioner. Denna metod kombinerar befintliga bild- och digitalanalystekniker i syfte att utöka multiplexeringskapaciteten och multiparameteranalysen av bildanalyser.
Transcript
Den rumsliga organisationen av immuncellerna i tumörmikromiljö har kliniskt värde. Denna strategi kan lätt användas för visualisering, kvantifiera, och kartläggning immunceller inom tumörvävnad. Immunterapi har revolutionerat cancerbehandling.
Alla patienter svarar dock inte bra. Denna strategi kan tjäna till att definiera vävnad-immun signaturer som kan förutsäga en bra anti-tumör svar. Innan du utför ett experiment, testa antikroppskombinationer och strippning tekniker på kontroll vävnader och kontrollera att APPs är korrekta i deras upptäckt av markörer av intresse.
Som skriftliga beskrivningar av bildanalysmetoder använder sofistikerade tekniska språk, kombinera text med video underlättar en bättre förståelse och replikering av metodiken. För antigen hämtning av formalin-fast, paraffin-inbäddade tumörvävnad sektioner, fördjupa dewaxed vävnadsprovet i en Coplin burk av antigen hämtning lösning och placera burken i en elektrisk tryckkokare som innehåller kranvatten. Vattennivån bör inte överstiga hälften av höjden på burken så att vattnet inte blandas med antigenhämtningslösningen.
Stäng locket och tryckventilen på spisen och behandla objektglasen med högt tryck i 10 minuter. I slutet av behandlingen, dra ur stickproppen, släpp trycket, och öppna locket. När bilderna har svalnat i spisen i 30 minuter, tvätta proverna två gånger i fem minuter i färska PBS per tvätt i en ny Coplin burk, sedan använda en hydrofoba penna för att dra en barriär runt varje vävnad avsnitt.
Sänk därefter ned bilderna i 0,1-molar glycin i PBS i 15 minuter i rumstemperatur innan du sköljer av objektglasen två gånger i PBS som visats. Efter den andra tvätten överför du objektglasen till en fuktighetskammare och täcker varje vävnadssektion med blockerande lösning. Efter 30 minuter vid rumstemperatur, skölj sektionerna två gånger i fem minuter i färsk PBS-Tween per tvätt sedan lägga till de primära antikroppar av intresse, utspädd i blockerande lösning, till varje objektglas, skyddas från ljus.
Vid slutet av inkubationen sköljer du objektglasen tre gånger i färsk PBS-Tween i fem minuter per tvätt, och märk sedan sektionerna med lämpliga sekundära antikroppar under en timme i rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen sköljer du objektglasen tre gånger i färsk PBS-Tween i fem minuter per tvätt. Följ upp med en enda sköljning i dubbeldestillerat vatten.
Ta bort överskottet av vatten från varje glid och montera vävnaderna med monteringsmedium kompletterat med DAPI och en täcksglas. Efter att ha klämt ut överskottet monteringsmediet, låt bilderna torka i 20 minuter i rumstemperatur, skyddad från ljus, innan du skaffar bilder för alla kanaler med hjälp av en hel-slide scanner. Efter skanning, öppna bilderna i bildanalysprogramvaran och klicka på fliken Tissuealign.
Om du vill importera bilderna som ska justeras till bildfältet väljer du den första bilden som ska justeras från databasen. När alla bilderna har lästs in klickar du på Nästa i stegen Arbetsflöde för att länka bilderna och dra och släppa alla bilder som ska justeras till den första bilden. När alla bilderna har länkats på lämpligt sätt, använd minst tre stift per bild som anger homologa vävnadsfunktioner i de länkade bilderna.
Använd en pin för att spåra den första bilden för att kontrollera kvaliteten på den resulterande justeringen. Om en tillfredsställande justering har erhållits klickar du på Nästa för att visa bildlagren och spara den sammansatta bilden i databasen. Om du vill utföra en vävnadsdetektering med det användardefinierade protokollet APP 1 öppnar du fliken Bildanalys och öppnar den sammansatta bilden i bildanalysmodulen.
Klicka på ikonen Öppna APP och markera lämplig APP. Bekräfta att APP fungerar genom att navigera till en vald vävnadsplats och klicka på Förhandsgranska. Om resultaten är tillfredsställande klickar du på för att bearbeta bilden med hjälp av den valda APPEN.
Under bearbetningen APP kommer att avgöra om pixel är associerad med vävnaden för att möjliggöra omvandling av alla vävnad-associerade pixlar till en region av intresse. Den nyskapade intresseregionen kan sedan överföras till någon av de justerade bilderna. I slutet av analysen klickar du på Arkiv och Spara för att spara den ändrade bilden med den nyskapade intresseregionen.
För segmentering av vävnaden till stroma och parenkyma öppnar du fliken Bildanalys och väljer de filer som är av intresse från databasen. Öppna APP 2, APP 2 använder den PSR-färgade bilden för vävnadssegmentering. Förhandsgranska APP 2 genom att bearbeta bilden i ett valt synfält.
Om resultaten är tillfredsställande klickar du på Kör för att bearbeta APP 2 på den fullständiga bilden. Regionen av intresse av vävnaden kommer att segmenteras i stroma och parenkym och deras respektive områden bestäms. De nyskapade områden av intresse för stroma och parenkym kan överföras till de justerade bilderna, sedan exportera och spara den ändrade bilden som visas.
Om du vill identifiera och kvantifiera cellpopulationer av intresse importerar du den segmenterade bilden av intresse till modulen för bildanalys. Efter justering av färgen, öppna APP 3. APP 3 kommer att upptäcka cellpopulationer av intresse och kvantifiera dem inom parenkymet och stroma.
Om resultaten är tillfredsställande, kör APP 3 på den fullständiga bilden. Alla enskilda celler av intresse kommer att märkas, deras vävnadskoordinater lagras, och tätheterna av cellerna av intresse i stroma och parenkymala regioner bestäms. Den ändrade bilden kan sedan sparas på det sätt som visas.
Om du vill utföra mjukpappersuppvärmning av de objekt med beteckningen cell-of-interest öppnar du lämpligt användardefinierat protokoll i APP-markeringsfönstret och klickar på Kör för att uppmana APP att använda koordinaterna för de antikroppsmärkta objekten för att generera värmekartan. Hot spot-områden, markerade med rött, innehåller den högsta tätheten av cellpopulationen av intresse medan de mörkblå områdena har den lägsta. Värmekartan över en specifik cellpopulation kan läggas ovanpå de justerade bilderna för att ge ytterligare information om hur dessa celler är organiserade inom tumörmikroomkroppen.
Sedan exportera och spara vävnad värme kartan. Det är viktigt att kontrollera märkningens specificitet, riktigheten hos de utformade APP:erna och den avskalade och reprobing effektiviteten hos de olika fläckarna på samma avsnitt. Genom att integrera seriell avbildning, sekventiell märkning och vävnadsjustering kan fler markörer visualiseras samtidigt och mer information kan extraheras från begränsade kliniska exemplar.
H&E färgning av resected tumör vävnad sektioner möjliggör utvärdering av vävnadsarkitektur, cell morfologi och kliniskt relevanta parametrar såsom typ av malignitet, tumör grade och övergripande immun infiltration. CD34 färgning gör det möjligt att upptäcka endotelceller. Cytokeratin 8/18 färgning avslöjar förekomsten av epitelceller, och anti-alfa glatta muskel aktin färgning gör det möjligt att identifiera fibrogenic, aktiveras, lever stellate celler.
Reprobing med antikroppar mot CD68 och Desmin möjliggör detektering av makrofager respektive myofibroblasts. För att bättre karakterisera tumör-immun infiltrate, kan färgning för T-cell markörer och myeloperoxidas utföras. Picro Sirius Red färgning kan också utföras för att visualisera fibrillar kollagen och för att underlätta stroma och parenchyma segmentering.
Vävnad-associerade pixlar inom de färgade sektionerna kan identifieras för att möjliggöra segmentering av olika fack inom en specifik region av intresse. Cellpopulationerna av intresse kan sedan identifieras inom varje region, vilket gör det möjligt att skapa vävnadskartor för vilka regioner med hög densitet för en viss cellpopulation visas som hotspots och regioner med relativt låg densitet visas som kalla fläckar. Denna metod för att identifiera, kvantifiera och kartlägga immunceller i vävnadsprover kan anpassas till och valideras för en specifik forskningsfrågor och markör för intresse.
Denna strategi kan tillämpas på vävnadsmikromatriser för analys med högt genomflöde. Det kan också kombineras med in situ hybridisering att samtidigt undersöka in situ protein och genuttryck. Vi har använt denna strategi för att identifiera och kartlägga IL-17A-producerande celler in situ i fibrotisk levervävnad från patienter.
Som anges i protokollet är flera reagenser kemiskt farliga och de relevanta förfarandena bör utföras i en kemisk huva med hjälp av lämplig personlig skyddsutrustning och lämpliga försiktighetsåtgärder.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
