Biochemistry
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视觉GPCR-迷你G蛋白信号复合物的战略筛选与表征，成功结晶
Summary March 16th, 2020
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本报告描述了不同的洗涤剂的筛选，以准备视觉GPCR，红蛋白，其复合与微型Go。演示了在纯化过程中不同阶段对复杂质量进行特征的生化方法。该协议可以推广为其他膜蛋白复合物，用于其未来的结构研究。
Transcript
信号转导是生物和制药研究中最重要的课题之一。它需要膜蛋白将信号传输到细胞内信号伙伴蛋白。该协议旨在进行系统洗涤剂筛选，以准备一个信号复合物，旨在结构测定。
该协议在成熟的生物学实验室中使用常用的技术，并且由该领域的初学者轻松执行。我们包括这些方法，以找到在制备膜蛋白复合物中最关键的参数。首先，将 30 克 HEK293 GNT I 缺陷细胞颗粒解冻至室温，然后转移到烧杯中。
加入120毫升PBS缓冲液，含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒和均匀使用Dounce均质器或电动均质器在13，000 RPM30秒。使用 PBS 缓冲液将音量调整到 150 毫升。轻轻将10%DDM加入均质细胞，使最终浓度为1.25%的搅拌在冰上一小时。
溶解后，将细胞在摄氏4度和15万度G下离心45分钟，以清除未溶解的碎屑。将上一液转移到500毫升的瓶子中，加入10毫升的50%1D4免疫亲和力加糖树脂。轻轻混合溶解细胞和树脂四小时或在四摄氏度下过夜，以允许蛋白质结合。
将落酸树脂混合物加载到开柱中以收集树脂。用 10 列洗涤缓冲液 A 清洗树脂以去除蛋白质污染物。关闭阀门，用两列缓冲液 A.Next 重新填充树脂，在昏暗的红灯条件下，在重新释放的树脂中加入 9-cis 视网膜，最终浓度为 50 微摩尔。
在黑暗中轻轻混合4摄氏度，4至16小时，进行视网膜结合。之后，打开该值并从列中删除缓冲区。用 20 列缓冲区 A 清洗树脂，然后用 15 列卷缓冲器 B 清洗树脂，以去除未绑定的视网膜。
将树脂重新悬浮在两列缓冲液 B 中，然后将树脂悬浮液平均划分为 10 个 10 毫升处置柱。从 10 柱中去除缓冲液，然后将树脂重新在一毫升缓冲液 C 中重新暂停，以更换洗涤剂。在冰上孵育一小时。
在缓冲器C中重复一次洗涤和孵育。从柱中去除缓冲液，然后每列以 0.8 毫升洗脱缓冲液重新暂停树脂。轻轻混合两小时。
将每个柱子的洗脱收集到管中。将树脂重新用于每列0.7毫升的洗脱缓冲液中。轻轻混合一小时。
将洗脱从每列收集到相同的管中。在黑暗中，将逃避的蛋白质加载到石英库中。测量蛋白质样本的光谱。
用495纳米长通滤波器的光通过，直接在库莱特中照亮蛋白质两分钟。测量照明样品的光谱。对其他九种洗涤剂中纯化的所有蛋白质样本进行相同的测量。
黑暗和照明状态。在正常光线下，对于每种洗涤剂，每毫升准备100微升的罗多普辛，每毫升0.7毫克。在昏暗的红灯下，以每毫升0.7毫克的速度准备100微升的罗多普辛混合物，以每毫升0.2毫克准备迷你戈。
用一毫摩尔氯化镁补充混合物。用495纳米长通滤波器的光照亮混合物，孵育30分钟。将样品转移到自动取样器小瓶中，并放在样品托盘中。
编程方法文件以自动运行每个样本的连续 SEC，自动采样器将样本的 77 微升加载到列中，净化器每次运行可清除 25 毫升的 SEC 缓冲区。记录 280 纳米和 380 纳米的吸收度。收集罗多普辛和罗多普辛-迷你-GO复合物的峰值分数，在12.9毫升左右的保留体积。
分析左罗多普辛样品和罗多普辛-迷你-GO复合物的峰值分数在4至12%SDS变性梯度凝胶与库马西蓝色染色。以每毫升 1 毫克和每毫升 0.01 毫克的 PNGase F 准备 200 微升的罗多普辛混合物。混合好，在冰上孵育过夜。
以每毫升一毫克和 Endo F1-13 以每毫升 0.01 毫克的速度准备 200 微升的罗多普辛混合物。混合好，在冰上孵育过夜。通过 SDS-Page 和库马西蓝色染色分析消化结果。
在这项研究中，小规模纯化装置产生了足够的蛋白质用于进一步分析。罗多普辛的紫外线可见光谱在蓝色曲线中显示 9-cis 视网膜绑定的罗多普辛。照明后，9-cis视网膜脱蛋白并异构化到所有跨视网膜。
280纳米的吸收剂比吸收剂488纳米的比例，280纳米的吸收剂比380纳米的吸收剂的比例，描述了每个洗涤剂中纯化的杜多普辛的稳定性。在10种不同的洗涤剂中纯化的罗多普辛和罗多普辛-迷你-GO复合物的大小排除色谱图显示在这里。标准标记蛋白的轮廓与 DDM 样品一起显示为叠加。
对于 DMNG，显示峰值配置文件的解释，其理想场景为 DDM、DM、Cymal-6、Cymal-5 和 OGNG。OGNG 样本的放大轮廓显示，罗多普辛和罗多普辛-迷你 GO 复合物都围绕相同的保留体积而消失。此处显示了对罗多普辛和 SEC 纯化的罗多普辛-迷你 GO 复合物样本的 SDS-Page 分析。
此图显示了与 Endo F1 和 PNGase F 酶的红松辛脱胶的 SDS-Page 分析。系统地进行洗涤剂筛选至关重要，这样，每个洗涤剂的影响都可以清晰地进行比较，而不会造成歧义。对于不同数量的蛋白质，热移测定也可用于研究洗涤剂对蛋白质稳定性的影响。
得益于这种方法，我们能够准备稳定的蛋白质复合物，并最终解决在地理装配中丢失的晶体结构。它为GPCR-G蛋白相互作用特异性提供了重要的见解。
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