Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Strategisk screening och karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex för framgångsrik kristallisering
Summary March 16th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denna rapport beskriver screening av olika rengöringsmedel för att förbereda den visuella GPCR, rhodopsin, och dess komplex med mini-Go. Biokemiska metoder som kännetecknar komplexets kvalitet i olika skeden under rening visas. Detta protokoll kan generaliseras till andra membran proteinkomplex för deras framtida strukturella studier.
Transcript
Signaltransduktion är ett av de viktigaste ämnena inom biologisk och farmaceutisk forskning. Det kräver membranproteiner att överföra signaler till deras intracellulära signalering partner protein. Detta protokoll är utformat för att utföra en systematisk tvättmedelsscreening vid beredning av ett signalkomplex som syftar till strukturbestämning.
Detta protokoll använder vanligt tillgängliga tekniker i ett väletablerat biologilaboratorium och lätt utföras av nybörjarna i sätta in. Vi bestod av dessa metoder för att hitta den mest kritiska parametern vid beredning av membranproteinkomplex. Till att börja med tina 30 gram HEK293 GNT I-bristfällig cell pellet till rumstemperatur och överföra den till en bägare.
Tillsätt 120 milliliter PBS-buffert som innehåller proteashämmare cocktail och homogen med hjälp av en Dounce homogenisator eller en elektrisk homogenisator vid 13, 000 RPM i 30 sekunder. Justera volymen till 150 milliliter med PBS-buffert. Tillsätt försiktigt 10%DDM till de homogeniserade cellerna för att ge en slutlig koncentration på 1,25%Rör om på is i en timme.
Efter solubilisering centrifuger cellen lysate vid fyra grader Celsius och 150, 000 gånger G i 45 minuter för att ta bort den olösta skräp. Överför supernatanten till en 500 milliliter flaska och tillsätt 10 milliliter av 50%1D4 immun-affinitet agarrose harts. Blanda försiktigt den solubiliserade cellen lysate och harts i fyra timmar eller över natten vid fyra grader Celsius för att tillåta proteinbindning.
Ladda lysatehartsblandningen till en öppen kolonn för att samla in kådan. Tvätta hartset med 10 kolonnvolymer av tvättbuffert A för att avlägsna proteinet föroreningar. Stäng ventilen och resuspend hartset med två kolumnvolymer av buffert A.Next, under svagt rött ljus skick, tillsätt 9-cis Retinal till den återanvända hartset till en slutlig koncentration av 50 mikromolar.
Blanda försiktigt vid fyra grader Celsius i fyra till 16 timmar i mörker för Retinal-bindning. Efter det öppnar du värdet och tar bort bufferten från kolumnen. Tvätta harts med 20 kolonnvolymer av buffert A, följt av 15 kolonnvolymer av buffert B för att avlägsna obundet Retinal.
Resuspend hartset i två kolumn volymer av buffert B och sedan dela harts suspensionen lika till 10 10 milliliter avyttring kolumner. Ta bort bufferten från de 10 kolumnerna och sedan resuspend hartset var och en i en milliliter buffert C för tvättmedel förändring. Inkubera i en timme på is.
Upprepa tvätten och inkubationen i buffert C en gång till. Ta bort bufferten från kolumnerna och sedan återanvända hartset i 0,8 milliliter elueringsbuffert för varje kolumn. Blanda försiktigt i två timmar.
Samla elueringen från varje kolumn i ett rör. Resuspend hartset i 0,7 milliliter elueringsbuffert för varje kolumn. Blanda försiktigt i en timme.
Samla elueringen från varje kolumn i samma rör. I mörkret, ladda eluded proteinet till kvartsen cuvette. Mät spektrumet av proteinprovet.
Belys proteinet direkt i cuvette i två minuter med ljus passera genom 495 nanometer långpassfilter. Mät det belysta provets spektrum. Utför samma mätning för alla proteinprover som renats i de övriga nio tvättmedlen.
Både mörka och upplysta tillstånd. Under normalt ljus, för varje rengöringsmedel skick förbereda 100 mikroliter av rhodopsin på 0,7 milligram per milliliter. Under svagt rött ljus, förbereda 100 mikroliter av blandning av rhodopsin på 0,7 milligram per milliliter och mini-GO på 0,2 milligram per milliliter.
Komplettera blandningen med en millimolar magnesiumklorid. Belys blandningen med ljus från ett 495 nanometer långpassfilter och inkubera i 30 minuter. Överför proverna till injektionsflaskan med autoprov och placera dem i provfacket.
Programmera en metodfil för att automatisera sekventiella SEC-körningar för varje prov med autoprovet som läser in 77 mikroliter av provet till kolonnen och renaren som undkommar 25 milliliter SEC-buffert per körning. Spela in absorbansen vid 280 nanometer och 380 nanometer. Samla toppfraktionerna av rhodopsin och rhodopsin-mini-GO-komplex vid retentionsvolymen runt 12,9 milliliter.
Analysera vänster rhodopsin prover och toppfraktioner av rhodopsin-mini-GO komplex på fyra till 12% SDS denaturering gradient geler med Coomassie blå färgning. Förbered en 200 microliter blandning av rhodopsin på ett milligram per milliliter och PNGase F på 0.01 milligram per milliliter. Blanda väl och inkubera på is över natten.
Förbered en 200 microliter blandning av rhodopsin på ett milligram per milliliter och Endo F1-13 på 0,01 milligram per milliliter. Blanda väl och inkubera på is över natten. Analysera matsmältningen resultatet av SDS-Page och Coomassie blå färgning.
I denna studie gav småskalig rening setup tillräckligt protein för ytterligare analyser. Ultraviolett synliga spektra av rhodopsin visar den mörka staten 9-cis Retinal bundna rhodopsin i blå kurvor. Efter belysning deproteiniseras 9-cis Retinal och isomeriseras till alla trans-Retinal.
Kvoterna för absorbenter vid 280 nanometer över absorbenter 488 nanometer och absorbenter vid 280 nanometer över absorbenter vid 380 nanometer skildrar stabiliteten hos rhodopsin som renats i varje rengöringsmedel. Storlek uteslutningskromatografi profiler av rhodopsin och rhodopsin-mini-GO komplex renas i 10 olika rengöringsmedel visas här. Standardmarkörproteinernas profil visas som överlagring tillsammans med DDM-provet.
Tolkningen av toppprofilerna visas för DMNG med det ideala scenariot som ses för DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 och OGNG. Den förstorade profilen för OGNG provet visar både rhodopsin och rhodopsin-mini-GO komplex gäckade runt samma kvarhållningsvolym. SDS-Page analys av rhodopsin och SEC renas prover av rhodopsin-mini-GO komplex visas här.
Denna figur visar SDS-Page-analysen av rhodopsin deglycosylation med Endo F1- och PNGase F-enzymer. Det är avgörande att utföra tvättmedelsscreening på ett systematiskt sätt, så att varje enskilt rengöringsmedels inverkan tydligt kan jämföras utan tvetydighet. För protein av olika mängd kan termisk skiftanalys också användas för att studera tvättmedels påverkan på proteinstabilitet.
Tack vare denna metod kan vi förbereda stabilt proteinkomplex och så småningom lösa den kristallstruktur som går förlorad i geo-montering. Det gav viktiga insikter i GPCR-G protein interaktion specificitet.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE