Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes
Chapters
Summary June 16th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.
Transcript
Dit protocol is belangrijk omdat het onderzoekers de vaardigheden biedt om donormensenharten in dienst te nemen voor preklinische fysiologische drugstesten. Dit weefsel maakt gebruik van zowel spanning en calcium kleurstoffen voor de gelijktijdige karakterisering van cardiale actie mogelijkheden en intracellulaire calcium transiënten in menselijk weefsel plakjes. Om het optische kaartsysteem op te zetten, bevestigt u een weefselbad met een bodem polydimethylsiloxaangellaag aan een perfusiesysteem en circuleert u één liter hersteloplossing bij 37 graden Celsius zuurstofrijk met 100% zuurstof door het perfusiesysteem met een stroomsnelheid die snel genoeg is om de temperatuur te handhaven en de accumulatie van badperfuseren te voorkomen.
Gebruik vervolgens een doel om de focus en uitlijning van de twee CMOS-camera's aan te passen en gebruik een groene LED-lichtbron met een golflengte van 520 plus of min vijf nanometer om de spanningsgevoelige en calciumindicatorkleurstoffen tegelijkertijd op te wekken. Voordat u weefselsecties verkrijgt, meng bevroren en vloeibare cardioplegiaoplossing en plaats het hartweefsel in het ijskoude cardioplegiabad en identificeer de linker ventriculaire vrije wand. Lijm de voorgemaakte agarosegel aan de achterkant van de metalen weefselhouders van het vibratome.
Snijd een centimeter in blokjes gesneden blokken weefsel in koude cardioplegic oplossing en gebruik actuele huidkleef om snel monteren van de weefselblokken op de metalen weefselhouders met de endocardial oppervlakken naar boven gericht. Breng de metalen houders in het vibratome bad van ijskoude zuurstofhoudende snijden oplossing, zodat de weefsels volledig onder water en verplaats het mes naar de voorkant van het weefsel. Zet het vibratome aan om te beginnen met snijden met de vooraf ingestelde parameters, gooi de eerste verschillende plakjes totdat het blad verder reikt dan de trabeculae in het gladde endocardiale weefsel.
Wanneer het experimentele weefsel is bereikt, zorgvuldig overbrengen van elk plakje in individuele 100 micrometer nylon mesh cell strainers in een cultuur schotel met kamertemperatuur zuurstofrijk Tyrode's herstel oplossing en bedek de plakjes met mesh ringen om het weefsel plakjes te houden van krullen. Wanneer alle plakjes zijn verzameld, breng je elk plakje voorzichtig over in afzonderlijke putten van een zesputige plaat met drie milliliter PBS per put. Spoel het plakje met zachte schommelen en herhaal dit proces drie keer met verse steriele PBS alvorens de monsters in individuele putten van een zes-put plaat met drie milliliter van 37 graden Celsius cultuurmedium per goed.
Plaats de plaat vervolgens op een orbitale shaker met 20 omwentelingen per minuut in een bevochtigde couveuse bij 37 graden, 30% zuurstof en 5% kooldioxide. Na 20 minuten incubatie in hersteloplossing voor vers gesneden plakjes of onmiddellijk na het kweken, breng het plakje rente voorzichtig over naar het weefselbad van het perfusiesysteem en zet de vier hoeken vast aan de gellaag terwijl u minimale rek op het weefsel toepast. Laat de plakjes in dit bad ongeveer 10 minuten rusten met circulerende hersteloplossing voordat u 0,3 tot 0,5 microliter stock Blebbistatin toevoegt aan het reservoir van hersteloplossing.
Terwijl de slice is uitbroeden in de Blebbistatin, reconstrueren 30 microliters van de voorraad spanning gevoelige kleurstof in een milliliter van herstel oplossing op 37 graden. Na 10 minuten behandeling van Blebbistatin, zet de pompen uit en laad langzaam 0,2 tot 0,3 milliliter werkende kleurstofoplossing op het oppervlak van de plak gedurende een periode van 30 seconden. Zet na 90 seconden de pompen aan om overtollige kleurstof uit te wassen.
Na het sterven van de slice met voorraad calcium indicator zoals net aangetoond, focus de camera's op het segment en tempo van de slice op een hertz met een twee milliseconde puls breedte duur op 1,5 keer de amplitude van de vooraf bepaalde pacing drempel. Plaats een coverslip over het weefsel segment en verlicht het segment met de LED-excitatie lichtbron. Noteert vervolgens de uitgezonden spannings- en calciumsignalen met de camera's op 1.000 frames per seconde.
Om de spannings- en calciumoptische toewijzingsgegevens in de juiste analysesoftware te conditioneren, klikt u op conditieparameters en verwijdert u de achtergrond. Pas vervolgens de parameters voor signaalconditionering aan om optimaal actiepotentieel en calciumtransientsporen te verkrijgen. Als u de geleidingssnelheid wilt berekenen, selecteert u activeringskaart en voert u een begin- en eindtijd in om één actiepotentieel in het spoor te omvatten.
Klik vervolgens op regionale kaart en selecteer het interessegebied om de activeringskaart van het geselecteerde gebied weer te geven. Selecteer vervolgens de geleidingssnelheidskaart en selecteer de begin- en eindtijden. Pas de waarden van de interpixelresolutie aan op basis van de installatie als dat nodig is.
Klik op vectorkaart genereren om een interessegebied te selecteren en de geleidingssnelheidsvectoren binnen dat gebied weer te geven. Het gemiddelde, de mediaan, de standaarddeviatie en het aantal vectoren dat in de analyse is opgenomen, evenals de gemiddelde voortplantingshoek van de geleidingssnelheidvectoren in het geselecteerde gebied, worden weergegeven. Als u de potentiële duur van de actie wilt berekenen, selecteert u de potentiële duur van de actie, de calciumsale duurkaart en selecteert u de begin- en eindtijden om één volledig actiepotentieel te omvatten.
Klik vervolgens op de berekening van de potentiële duur van regionale actie om een interessegebied te selecteren en om de actiepotentieelskaart te genereren. Om de stijgingstijd te bepalen, selecteert u de stijgingstijd en selecteert u de begin- en eindtijden om de upstroke van één enkele actiepotentieel of calciumtransient te selecteren. Voer de begin- en eindpercentagewaarden in en klik op berekenen om het interessegebied te selecteren en het gemiddelde, de mediaan, de standaarddeviatie en het aantal pixels te bepalen dat is opgenomen in de analyse van de stijgingstijd.
Om het calciumbederf te bepalen, selecteer je calciumverval en voer je de begin- en eindtijden in om het gehele vervalgedeelte van een enkel calciumtransient signaal te omvatten. Klik vervolgens op tau berekenen om het interessegebied te selecteren en om het gemiddelde, mediaan, standaarddeviatie en het aantal pixels in de analyse van calciumbederftijdconstante te bepalen. In dit representatieve experiment werden het werkingspotentieel en calcium voorbijgaande sporen geconditioneerd.
De activeringstijden werden bepaald voor elke pixel en isochronale kaarten van de activeringstijden werden uitgezet van de geconditioneerde spanning en calciumsporen. Geleidingssnelheidsvectoren werden berekend aan de hand van de activeringstijden en de bekende interpixelresolutie. De calcium voorbijgaande vervalconstante werd gemeten door een polynoom aan het rottende gedeelte van de calciumsporen te plaatsen.
De actie potentiële duur en calcium voorbijgaande duur werden gemeten als de tijdsduur tussen de activeringstijd en een bepaald percentage van de re-polarisatie of calcium verwijdering van het cytoplasma respectievelijk. De stijgingstijden van de spanning en calciumsporen werden ook gemeten en in kaart gebracht. In deze representatieve analyse werd het effect van doxorubicine op cardiale geleiding getest, wat resulteerde in een vermindering van de transversale geleidingssnelheid.
Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de plakjes in volledige cardioplegische arrestatie zijn om schade aan het weefsel tijdens de snijprocedure te minimaliseren en om levensvatbare plakjes te verkrijgen. Aan het einde van het protocol kunnen de plakjes worden ingevroren of gerepareerd voor moleculaire beoordeling. De mechanistische trajecten die betrokken zijn bij het elektrofysiologische fenomeen van belang kunnen dan worden bepaald.
De ontwikkeling van dit menselijke cardiale segmentmodel heeft de studie van de reacties op behandelingen en ziekte in menselijk hartweefsel toegestaan die de kloof tussen dierlijke en klinische studies overbruggen. Bij het werken met menselijke weefsels tijdens het uitvoeren van deze techniek, moet u de juiste PBM dragen en alle andere noodzakelijke veiligheidsmaatregelen nemen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
