Bioengineering
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Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana
Chapters
Summary June 16th, 2020
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Questo protocollo descrive la procedura per sezionare e coltivare fette cardiache umane per test preclinici sui farmaci e descrive in dettaglio l'uso della mappatura ottica per la registrazione simultanea della tensione transmembrana e dei segnali di calcio intracellulare da queste fette.
Transcript
Questo protocollo è significativo perché fornisce ai ricercatori le capacità di impiegare cuori umani donatori per test fisiologici preclinici sui farmaci. Questo tessuto utilizza sia coloranti di tensione che di calcio per la caratterizzazione simultanea di potenziali di azione cardiaca e transitori di calcio intracellulare nelle fette di tessuto umano. Per impostare il sistema di mappatura ottica, attaccare un bagno di tessuto con uno strato di gel polidimetilsiloxano inferiore a un sistema di perfusione e far circolare un litro di soluzione di recupero a 37 gradi Celsius ossigenato con ossigeno al 100% attraverso il sistema di perfusione a una portata abbastanza veloce da mantenere la temperatura e prevenire l'accumulo di perfusato di bagno.
Quindi utilizzare un bersaglio per regolare la messa a fuoco e l'allineamento delle due telecamere CMOS e utilizzare una sorgente di luce LED verde con una lunghezza d'onda di 520 più o meno cinque nanometri per eccitare simultaneamente i coloranti sensibili alla tensione e agli indicatori di calcio. Prima di ottenere sezioni tissutali, mescolare la soluzione di cardioplegia congelata e liquida e posizionare il tessuto cardiaco nel bagno cardioplegia ghiacciato e identificare la parete libera ventricolare sinistra. Incollare il gel di agarosio prefatti sul retro dei supporti in tessuto metallico del vibratoma.
Tagliare blocchi di tessuto a cubetti di un centimetro in soluzione cardioplegica fredda e utilizzare adesivo cutaneo topico per montare rapidamente i blocchi di tessuto sui supporti dei tessuti metallici con le superfici endocardiche rivolte verso l'alto. Trasferire i supporti metallici nel bagno vibratomo della soluzione di affettamento ossigenato ghiacciato in modo che i tessuti siano completamente sommersi e spostare la lama sul bordo anteriore del tessuto. Accendere il vibratoma per iniziare a tagliare con i parametri preimpostati, scartando le prime fette fino a quando la lama non raggiunge oltre le trabecule nel tessuto endocardico liscio.
Una volta raggiunto il tessuto sperimentale, trasferire accuratamente ogni fetta in singoli filtri cellulari in rete di nylon da 100 micrometri in un piatto di coltura contenente la soluzione di recupero del Tirolo ossigenato a temperatura ambiente e coprire le fette con rondelle a rete per evitare che le fette di tessuto si arriccino. Una volta raccolte tutte le fette, trasferire accuratamente ogni fetta in singoli pozzi di una piastra a sei po porsi contenente tre millilitri di PBS per pozzo. Risciacquare la fetta con una leggera dondolo e ripetere questo processo tre volte con PBS sterile fresco prima di trasferire i campioni in singoli pozzi di una piastra a sei poggiale contenente tre millilitri di 37 gradi Celsius terreno di coltura per pozzo.
Quindi posizionare la piastra su uno shaker orbitale a 20 giri al minuto in un incubatore umidificato a 37 gradi, 30% ossigeno e 5% di anidride carbonica. Dopo 20 minuti di incubazione in soluzione di recupero per fette appena tagliate o subito dopo la coltura, trasferire con cura la fetta di interesse al bagno di tessuto del sistema di perfusione e fissare i quattro angoli allo strato di gel applicando un tratto minimo al tessuto. Lasciare riposare le fette in questo bagno con soluzione di recupero circolante per circa 10 minuti prima di aggiungere da 0,3 a 0,5 microlitri di Blebbistatin di serie al serbatoio della soluzione di recupero.
Mentre la fetta sta incubando nella Blebbistatin, ricostituire 30 microlitri del colorante sensibile alla tensione di magazzino in un millilitro di soluzione di recupero a 37 gradi. Dopo 10 minuti di trattamento con Blebbistatin, spegnere le pompe e caricare lentamente da 0,2 a 0,3 millilitri di soluzione di colorante funzionante sulla superficie della fetta per un periodo di 30 secondi. Dopo 90 secondi, accendere le pompe per lavare via qualsiasi colorante in eccesso.
Dopo aver moreto la fetta con l'indicatore di calcio stock come appena dimostrato, focalizza le telecamere sulla fetta e cammina la fetta con un hertz con una durata dell'impulso di due millisecondi a 1,5 volte l'ampiezza della soglia di stimolazione predeterminata. Posizionare un copriletto sopra la fetta di tessuto e illuminare la fetta con la sorgente luminosa di eccitazione a LED. Quindi registrare i segnali di tensione e calcio emessi con le telecamere a 1.000 fotogrammi al secondo.
Per condizionare i dati di mappatura ottica di tensione e calcio, nell'apposito software di analisi, fare clic sui parametri delle condizioni e rimuovere lo sfondo. Quindi regolare i parametri di condizionamento del segnale per ottenere un potenziale di azione ottimale e tracce transitori di calcio. Per calcolare la velocità di conduzione, selezionare la mappa di attivazione e immettere un'ora di inizio e fine per includere un singolo potenziale di azione nella traccia.
Quindi fare clic sulla mappa regionale e selezionare l'area di interesse per visualizzare la mappa di attivazione dell'area selezionata. Quindi, selezionare la mappa della velocità di conduzione e selezionare gli orari di inizio e fine. Regolare i valori di risoluzione tra pixel in base alla configurazione in base alle esigenze.
Fate clic su genera mappa vettoriale (generate vector map) per selezionare una regione di interesse e visualizzare i vettori di velocità di conduzione all'interno di tale regione. Verranno visualizzati la media, la mediana, la deviazione standard e il numero di vettori inclusi nell'analisi, nonché l'angolo medio di propagazione dei vettori di velocità di conduzione nella regione selezionata. Per calcolare la durata potenziale dell'azione, selezionare la durata potenziale dell'azione, la mappa della durata transitoria del calcio e selezionare gli orari di inizio e fine per includere un potenziale di azione completo.
Quindi fare clic sul calcolo della durata potenziale dell'azione regionale per selezionare un'area di interesse e generare la mappa della durata potenziale dell'azione. Per determinare il tempo di salita, selezionare il tempo di salita e selezionare gli orari di inizio e fine per selezionare la salita di un singolo potenziale di azione o transitorio di calcio. Immettere i valori percentuali iniziale e finale e fare clic su calcola per selezionare l'area di interesse e determinare la media, la mediana, la deviazione standard e il numero di pixel inclusi nell'analisi del tempo di ascesa.
Per determinare il decadimento del calcio, selezionare il decadimento del calcio ed entrare nei tempi di inizio e fine per includere l'intera porzione di decadimento di un singolo segnale transitorio di calcio. Quindi fare clic su calcola tau per selezionare la regione di interesse e determinare la media, mediana, deviazione standard e il numero di pixel inclusi nell'analisi della costante del tempo di decadimento del calcio. In questo esperimento rappresentativo, il potenziale d'azione e le tracce transitori di calcio erano condizionate al segnale.
I tempi di attivazione sono stati determinati per ogni pixel e le mappe isocronali dei tempi di attivazione sono state tracciate dalla tensione condizionata e dalle tracce di calcio. I vettori di velocità di conduzione sono stati calcolati utilizzando i tempi di attivazione e la risoluzione inter-pixel nota. La costante di decadimento transitorio del calcio è stata misurata adattando un polinomio alla porzione in decomposizione delle tracce di calcio.
La durata potenziale d'azione e la durata transitoria del calcio sono state misurate come durata del tempo tra il tempo di attivazione e una percentuale specificata della ri-polarizzazione o rimozione del calcio dal citoplasma rispettivamente. Sono stati misurati e mappati anche i tempi di aumento delle tracce di tensione e calcio. In questa analisi rappresentativa, è stato testato l'effetto della doxorubicina sulla conduzione cardiaca, con conseguente riduzione della velocità di conduzione trasversale.
È importante assicurarsi che le fette siano in completo arresto cardioplegico per ridurre al minimo i danni al tessuto durante la procedura di affettare e ottenere fette vitali. Alla fine del protocollo, le fette possono essere congelate o fissate per la valutazione molecolare. Si possono quindi determinare le vie meccaniche coinvolte nel fenomeno elettrofisiologico di interesse.
Lo sviluppo di questo modello di fetta cardiaca umana ha permesso lo studio delle risposte ai trattamenti e alle malattie nel tessuto cardiaco umano colmando il divario tra studi animali e clinici. Quando si lavora con tessuti umani durante l'esecuzione di questa tecnica, assicurarsi di indossare i DPI appropriati e di prendere tutte le altre precauzioni di sicurezza necessarie.
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