Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Доклиническая кардиологическая электрофизиология по двойному напряжению и оптическому картированию кальция органов человеческого сердца
Chapters
Summary June 16th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Этот протокол описывает процедуру секционирования и культивирования человеческих сердечных ломтиков для доклинического тестирования на наркотики и подробно описывает использование оптического картирования для записи трансмембранное напряжение и внутриклеточные сигналы кальция одновременно из этих ломтиков.
Transcript
Этот протокол имеет важное значение, поскольку он предоставляет исследователям навыки для использования донорских человеческих сердец для доклинкического физиологического тестирования на наркотики. Эта ткань использует как напряжение, так и красители кальция для одновременной характеристики сердечных потенциалов действия и внутриклеточного кальция переходных в человеческих тканей ломтиками. Чтобы настроить оптическую картографическую систему, прикрепите тканевую ванну с нижним слоем полидиметилсилоксанового геля к системе перфузии и распространяем один литр восстановительного раствора при температуре 37 градусов по Цельсию, насыщенной 100%-ным кислородом через систему перфузии со скоростью потока достаточно быстро, чтобы поддерживать температуру и предотвращать накопление перфузы ванны.
Затем используйте цель, чтобы настроить фокус и выравнивание двух камер CMOS и использовать зеленый светодиодный источник света с длиной волны 520 плюс-минус пять нанометров, чтобы возбудить чувствительные к напряжению и красители индикатора кальция одновременно. Перед получением разделов тканей, смешать замороженные и жидкие раствор кардиоплегии и поместить сердечную ткань в ледяную ванну кардиоплегии и определить левый желудочковой свободной стенки. Клей предварительно сделанный гель агарозы к задней части металлических держателей ткани вибромы.
Вырезать один сантиметр кубированных блоков ткани в холодном кардиоплегическом растворе и использовать актуальные клей кожи быстро смонтировать блоки ткани на металлические держатели тканей с эндокарда поверхностей лицом вверх. Перенесите металлические держатели в вибрационную ванну ледяного кислородного нарезания раствора так, чтобы ткани были полностью погружены в воду и переместить лезвие к переднему краю ткани. Включите вибром, чтобы начать нарезку с заданными параметрами, отбрасывая первые несколько ломтиков, пока лезвие не достигнет за trabeculae в гладкой ткани эндокарда.
Когда экспериментальная ткань была достигнута, тщательно передать каждый ломтик в отдельных 100 микрометров нейлоновых сетчатых клеток ситечкой в культуре блюдо, содержащее комнатную температуру кислородом раствор восстановления Tyrode и покрыть ломтики сетки шайбы держать ткани ломтиками от керлинга. Когда все ломтики были собраны, тщательно перенесите каждый кусочек в отдельные колодцы из шести скважин пластины, содержащей три миллилитров PBS на скважину. Промыть ломтик с нежным качания и повторить этот процесс три раза со свежим стерильным PBS перед передачей образцов в отдельных скважин из шести скважин пластины, содержащей три миллилитров 37 градусов по Цельсию культуры среды на колодец.
Затем поместите пластину на орбитальный шейкер со 20 оборотами в минуту во влажном инкубаторе при 37 градусах, 30%кислороде и 5%углекислом газе. После 20 минут инкубации в восстановительном растворе для свежесрезанные ломтики или сразу же после культивирования, тщательно перенесите кусочек интереса к ванне ткани перфузионной системы и прикрепите четыре угла к гелевому слою, применяя минимальный участок к ткани. Разрешить ломтики отдохнуть в этой ванне с циркулирующим раствором восстановления в течение примерно 10 минут, прежде чем добавить 0,3 до 0,5 микролитров бульона Blebbistatin в резервуар восстановления раствора.
В то время как ломтик инкубирует в Blebbistatin, восстановить 30 микролитров запаса напряжения чувствительный краситель в один миллилитр раствора восстановления на 37 градусов. После 10 минут обработки Blebbistatin, выключите насосы и медленно загрузить 0,2 до 0,3 миллилитров рабочего раствора красителя на поверхность ломтика в течение 30 секунд. Через 90 секунд включите насосы, чтобы вымыть излишки красителя.
После смерти ломтик с запасом кальция индикатор, как только что продемонстрировали, сосредоточить камеры на ломтик и темп ломтик на один герц с двух миллисекундной шириной пульса продолжительность в 1,5 раза амплитуды предопределенного порога темпа. Поместите крышку над ломтиком ткани и осветите ломтик светодиодным источником света возбуждения. Затем замитмить испускаемое напряжение и кальций сигналами с помощью камер со скорости 1000 кадров в секунду.
Для состояния данных оптического картирования напряжения и кальция, в соответствующем программном обеспечении анализа, нажмите параметры состояния и удалите фон. Затем отрегулируйте параметры кондиционирования сигнала, чтобы получить оптимальный потенциал действия и преходящие следы кальция. Чтобы рассчитать скорость проводимости, выберите карту активации и введите время начала и окончания, чтобы охватить один потенциал действия в следе.
Затем нажмите на региональную карту и выберите область, интересную для отображения карты активации выбранного региона. Далее выберите карту скорости проводимости и выберите время начала и окончания. При необходимости отрегулируйте значения межми пиксельного разрешения на основе настройки.
Нажмите на карту вектора, чтобы выбрать область, представляющий интерес, и отобразить векторы скорости проводимости в этом регионе. Будет отображаться среднее, среднее, стандартное отклонение и количество векторов, включенных в анализ, а также средний угол распространения векторов скорости проводимости в выбранном регионе. Чтобы рассчитать потенциальную продолжительность действия, выберите потенциальную продолжительность действия, карту переходной продолжительности кальция и выберите время начала и конца, чтобы охватить один полный потенциал действия.
Затем нажмите региональный расчет потенциальной продолжительности действия, чтобы выбрать область, интересную и создать карту потенциальной продолжительности действия. Чтобы определить время подъема, выберите время подъема и выберите время начала и окончания, чтобы выбрать upstroke одного единственного потенциала действия или кальция переходных. Введите значения начала и конца процента и нажмите вычислить, чтобы выбрать область интереса и определить среднее, среднее, стандартное отклонение и количество пикселей, включенных в анализ времени роста.
Чтобы определить распад кальция, выберите распад кальция и введите время начала и конца, чтобы охватить всю часть распада одного переходного сигнала кальция. Затем нажмите вычислить тау, чтобы выбрать область интереса и определить среднее, среднее, стандартное отклонение и количество пикселей, включенных в анализ времени распада кальция. В этом репрезентативном эксперименте, потенциал действия и кальция переходные следы были обусловлены сигналом.
Время активации определялось для каждого пикселя, а изохрональные карты времени активации были построены по условным следам напряжения и кальция. Векторы скорости проводимости рассчитывались с использованием времени активации и известного межки пиксельного разрешения. Постоянная преходящая распада кальция измерялась путем установки полиномии на разлагающуюся часть следов кальция.
Потенциальная продолжительность действия и преходящая продолжительность кальция измерялись как продолжительность времени между временем активации и указанным процентом повторной поляризации или удаления кальция из цитоплазмы соответственно. Также были измерены и отображены время повышения напряжения и следов кальция. В этом репрезентативном анализе было проверено влияние доксорубицина на сердечное поведение, что привело к снижению скорости поперечного проведения.
Важно, чтобы убедиться, что ломтики находятся в полном кардиоплегическом аресте, чтобы свести к минимуму повреждение тканей во время процедуры нарезки и получить жизнеспособные ломтики. В конце протокола ломтики могут быть заморожены или зафиксированы для молекулярной оценки. Механистические пути, участвующие в электрофизиологическом явлении, представляющие интерес, могут быть определены.
Разработка этой модели сердечного среза человека позволила изучить реакцию на лечение и болезни в сердечной ткани человека, преодолев разрыв между исследованиями на животных и клинических исследованиях. При работе с человеческими тканями при выполнении этой техники, не забудьте носить соответствующие СИЗ и принимать любые другие необходимые меры предосторожности.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
