Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Visar ett linjärt samband mellan vaskulär endotelial tillväxtfaktor och luteiniserande hormon i njure cortex extrakt
Chapters
Summary January 22nd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Presenteras här är ett protokoll för att utnyttja en kortikal njure extrakt beredning och totalprotein normalisering för att demonstrera sambandet mellan vaskulär endotelial tillväxtfaktor och luteiniserande hormon i däggdjurs njure.
Transcript
Vårt protokoll observerar att användningen av njure extrakt från kor och svin är en utmärkt och ekonomisk resurs för studier av njurmedicinska fysiologi, särskilt undersöka sambandet mellan Vaskulär endotel tillväxtfaktor och andra analyter. Det har alltid varit en utmaning att korrelera VEGF, en viktig tillväxtfaktor i organ angiogenes, med andra proteiner. Denna teknik gör det möjligt för oss att undersöka sambandet mellan VEGF och analyter såsom hormoner.
Detta kommer säkert att främja vår bas av kunskap när det gäller denna viktiga tillväxtfaktor. Denna metod kan vara användbart för korrelera andra analyter i njure när extrakt förutom de som nämns i denna video. Visuell demonstration kommer att hjälpa andra att få reproducerbara resultat utan några provtagningsfel.
Användningen av färsk vävnad är avgörande för framgången för denna teknik. Det är viktigt att få färska hela njurar omedelbart efter slakt från ett djur. Överför alltid vävnaden till laboratoriet på is.
Använd steril sax, tlysningar, en kniv, och Petri rätter att dissekera njurar och punktskatt den nödvändiga vävnaden portion. Skär försiktigt njuren i hälften längs sagittal planet och skär en bit vävnad från cortex regionen i mitten av njuren. Finhacka vävnaden i små bitar med kniven och överför den till ett mikrofugeringsrör med en milliliter iskall 1X RIPA-lysningsbuffert.
Märk tuben med specifika provdetaljer och placera det på is. Använd en handhållen homogenisator med en steril sond för att homogenisera vävnaden i en till två minuter tills inga bitar är synliga, sedan omedelbart centrifug röret vid 9, 600 gånger g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Efter centrifugeringen, bered separata alikvoter av provet för ELISA och total proteinanalys för att undvika flera frys-/töcykler.
Innan analysen startas, ta med alla reagenser och analysplattan till rumstemperatur som tar bort de överflödiga brunnarna och förvarar dem i fyra grader Celsius tills vidare används. Späd 20X tvättbufferten till 300 milliliter med dubbelt destillerat vatten och ställ in de tomma brunnarna utan någon lösning. Tillsätt 50 mikroliter av standard eller prov och ytterligare 50 mikroliter pepparrotperoxid konjugat till varje brunn, sedan omedelbart lägga till 50 mikroliter av antikroppslösning till varje brunn och försegla plattan.
Blanda plattan och inkubera den i 37 grader Celsius i en timme. Efter inkubationen, tvätta varje brunn med 200 mikroliter av tvättbuffert. Tillsätt 50 mikroliter av substrat A och substrat B till varje brunn, blanda plattan försiktigt genom att knacka på sidan, sedan försegla och inkubera den i mörker i 15 minuter vid 37 grader Celsius.
Lägg till 50 mikroliter av stopplösning till varje brunn. Knacka försiktigt på plattan och läs av absorbansen vid 450 nanometer med en spektrofotometer. Förbered reagenserna och tvätta buffert som tidigare beskrivits, tillsätt sedan 100 mikroliter av standard eller prov till varje brunn, försegla plattan, blanda väl, och inkubera den i två timmar vid 37 grader Celsius.
Ta bort vätskan i varje brunn och tillsätt 100 mikroliter av detektionsreagens A.Försegla plattan och inkubera den i ytterligare en timme. Därefter tvätta varje brunn med 400 mikroliter tvättbuffert, tillsätt sedan 90 mikroliter substratlösning till varje brunn, knacka försiktigt på plattan och inkubera den i ytterligare en timme vid 37 grader Celsius. Efter den sista inkubationen, tillsätt 50 mikroliter stopplösning till varje brunn, knacka försiktigt på plattan och avläsa absorbansen vid 450 nanometer med en spektrofotometer.
Uppskatta det totala proteinet av njurextrakten för nötkreatur och svin med en standard BSA-analys och använd denna uppskattning för att normalisera resultaten av LH och VEGF-A-ELISA. Medelvärdet och mediannivåerna för LH och VEGF beräknades för både djur och kön. Efter att ha verifierat normalitet av data, linjär regression modeller utnyttjades för att undersöka förhållandet mellan LH och VEGF.
LH konstaterades vara en stark och betydande prediktor för VEGF i både nötkreatur och svin njurar. Vid försök till detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att prov identiska områden i varje vävnad. Ett liknande förfarande kan användas för att extrahera någon typ av vävnad.
Kom ihåg att normalisera analyter av totalt proteinextrakt av oavsett vävnad du använder.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
