Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En intravital mikroskopi-baseret tilgang til vurdering af intestinal permeabilitet og epitelcelle shedding performance
Summary December 3rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Drage fordel af intravital mikroskopi, den metode, der præsenteres her gør det muligt real-time visualisering af intestinal epitelcelle udgydelse i levende dyr. Derfor, topisk plettet tarmslimhinden (acriflavine og rhodamineB-dextran) af bedøvede mus er afbildet op til encellet opløsning ved hjælp af konfokal mikroskopi.
Transcript
Ved hjælp af intravital mikroskopi muliggør denne protokol real-time visualisering af tarmvæv op til en enkeltcelleopløsning og studiet af meget dynamiske processer såsom celleudgydelse. I kombination med standardsporingsforsøgene gør denne protokol det muligt at identificere både tarmpermeabilitetsforstyrrelser in vivo og sondringen mellem para og transcellulær permeabilitet. Denne protokol kan bruges som grundlag for udvikling af yderligere intravital mikroskopi tilgange til visualisering af andre meget dynamiske cellulære processer af interesser inden for forskellige væv.
Visuel demonstration af denne metode er afgørende for at forstå de kirurgiske forberedelsestrin og for at placere det levende dyr på en måde, der letter billedoplevelsen på tarmhinden. Før proceduren påbegyndes, skal du tænde for basen og scannerboksen på et konfokalt laserscanningsmikroskop, og tryk på start for at tænde computeren. Start billedopkøbssoftwaren, og vælg den relevante konfiguration.
Hvis du vil angive den relevante billedopløsning, skal du vælge konfiguration, hardware, opløsning, bitdybde og 12. Vælg XYZT for billedopkøbstilstanden under anskaffelsesmenuen, og sæt målet til 20 eller 40X. Hvis du vil konfigurere indstillingen for sekventiel anskaffelse, skal du klikke på Søg og tilføj og vælg mellem rammer.
Hvis du vil konfigurere sekvens et, skal du aktivere den synlige laserboks. Indstil fotomultiplier rør en til på og definere emission bølgelængde. Hvis du vil konfigurere sekvens to, skal du aktivere den synlige laserboks.
Indstil fotomultiplier rør to til på og definere emission bølgelængde. Aktiver derefter de relevante lasere. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids, bruge en vatpind til at anvende salve til øjnene af bedøvet mus og gøre en en centimeter snit i venstre ventrikel region af maven.
Brug scepper til at eksteriere en tre til fem centimeter segment af tarmen. Lav to små snit øverst og nederst i tarmsegmentet og indfør et glasmikropipette i tarmlummen. Brug derefter elektrocauterization til at åbne det eksteriøriserede tarmsegment i længderetningen langs den anti-mesenteriske side og eksponere slimhinden.
Skyl vævsvævet kortvarigt med saltvandsopløsning for at fjerne fækalindholdet. Til farvning af tarmslimhinden påføres 100 mikroliter af en milligram pr. milliliter acriflavinopløsning i dråber på den eksponerede slimhindeoverflade, og pletten kan udvikles i tre minutter, før den resterende opløsning vaskes ud med PBS. Derefter anvendes 100 mikroliter af en to milligram pr. milliliterrrrucamin dextranopløsning i dråber til slimhinden i tre minutters inkubation før vask med PBS.
Derefter placeres bedøvet mus liggende på et dæksel monteret på kammeret skyllet med 37 grader Celsius saltvand, justere positionen, hvis det er nødvendigt, og placere præparatet på den omvendte mikroskop fase. Umiddelbart efter at musen er placeret på scenen, skal du tænde for lyskilden og justere XY-positionen, indtil belysningsaksen er fokuseret på vævspræparatet. Vælg den relevante filterkube for at vælge synsfeltet.
Åbn lukkeren og bruge makro og mikro hjul til at fokusere på overfladen af tarmslimhinden. Juster XY-positionen for at finde et område, hvor flere villi kan visualiseres i synsfeltet, og skift filterkuben for at kontrollere, at rhodamine dextran-farvningen også er synlig i det pågældende område. Når et interesseområde er blevet identificeret, skal du starte billedoperækkelsen og vælge sekvens et for at justere lasereffekten, forstærkningen og forskydningen for sekvens et.
Vælg derefter sekvens to, og juster lasereffekten, forstærkning og forskydning for sekvens to. Hvis du vil definere Z-stack-området, skal du åbne drop-off-menuen Z-stack. Brug Z-adgangskontrol til at fokusere på overfladen af slimhinden og klik begynde.
Fokuser på den nederste grænse for, hvor signalet stadig kan registreres, og klik på ende. Definer antallet af Z-stakke, undgå tidsforfald længere end to minutter for to på hinanden følgende tidspunkter og åbne tidsmenuen for at vælge minimere og erhverve indtil stop. Hvis du vil definere linjegennemsnittet, skal du vælge Søg efter et, linjegennemsnit to, søg to og linjegennemsnit to.
Derefter at erhverve billeder, skal du indstille formatet til 1024 x 1024 pixels og hastigheden til 400 og klik start. Intestinal epitelcelle-specifikke GGTase mangelfuld betingede mus udviklet svær intestinal patologi som påvist ved en stigning i histologiske skader score af tyndtarmen og øget intestinal epitelperabilitet kan også påvises via sporstof i in-vivo eksperimenter ved hjælp af oralt administreret FITC-dextran. Celle kaste begivenheder kunne identificeres som celler bevæger sig ud af epitelmonolayer i lumen, fører til midlertidige huller i loftet af epitel, der er endeligt lukket af kontakten mellem de omkringliggende celler, en såkaldt lynlås effekt.
Disse huller er observeret i både kontrol og GGTase mangelfuld mus, selv om hyppigheden af disse fænomen er højere i sidstnævnte. Interessant, andre celler synes også at optagelse dextran. Disse såkaldte gennemtrængelige cellehændelser forekommer også hovedsageligt i betingede knockoutmus.
Immunostaining af cytoskelet-relaterede og stramme kryds proteiner af interesse kan udføres for at identificere specifikke mål, der bidrager til potentielle epitelperibilitet forstyrrelser bestemmes via intravital mikroskopi. Denne metode kan anvendes til analyse af andre fænomener på overfladen af tarmslimhinden, såsom endotellækage eller immun epitelkommunikation i forbindelse med tarminfektion.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
