Immunology and Infection
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आंतों की पारगम्यता और एपिथेलियल सेल शेडिंग प्रदर्शन का आकलन करने के लिए एक इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी-आधारित दृष्टिकोण
Summary December 3rd, 2020
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इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी का लाभ उठाते हुए, यहां प्रस्तुत विधि जीवित जानवरों में आंतों के एपिथेलियल सेल शेडिंग के वास्तविक समय के दृश्य को सक्षम बनाती है। इसलिए, एनेस्थेटाइज्ड चूहों के सामयिक रूप से दाग वाली आंतों म्यूकोसा (एक्क्रिमेन और रोडामाइन-डेक्सट्रान) को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन तक इमेज किया जाता है।
Transcript
इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, यह प्रोटोकॉल आंतों के ऊतकों के वास्तविक समय के दृश्य को एकल-कोशिका संकल्प और सेल शेडिंग जैसी अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं के अध्ययन में सक्षम बनाता है। मानक ट्रेसर प्रयोगों के संयोजन में, यह प्रोटोकॉल वीवो में आंतों की पारियता गड़बड़ी और पैरा और पारकोशल पारमेबिलिटी के बीच अंतर दोनों की पहचान की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न ऊतकों के भीतर हितों की अन्य अत्यधिक गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं की कल्पना के लिए अतिरिक्त इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोणों के विकास के आधार के रूप में किया जा सकता है।
इस विधि का दृश्य प्रदर्शन शल्य तैयारी चरणों को समझने और जीवित जानवर को इस तरह से स्थिति में रखने के लिए आवश्यक है जो आंतों की म्यूकोसल सतह पर छवि अधिग्रहण की सुविधा प्रदान करता है। प्रक्रिया शुरू करने से पहले, एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के आधार और स्कैनर बॉक्स को चालू करें और कंप्यूटर को चालू करने के लिए प्रेस स्टार्ट करें। छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और उपयुक्त विन्यास का चयन करें।
उपयुक्त छवि संकल्प सेट करने के लिए, विन्यास, हार्डवेयर, संकल्प, बिट गहराई, और 12 का चयन करें। अधिग्रहण मेनू के तहत, छवि अधिग्रहण मोड के लिए XYZT का चयन करें और उद्देश्य को 20 या 40X सेट करें। अनुक्रमिक अधिग्रहण सेटिंग स्थापित करने के लिए, फ़्रेम के बीच खोज और जोड़ने और चयन पर क्लिक करें।
अनुक्रम एक को कॉन्फ़िगर करने के लिए, दृश्य लेजर बॉक्स चालू करें। उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य को परिभाषित करने के लिए फोटोमुलिटिपल ट्यूब एक सेट करें। अनुक्रम दो को कॉन्फ़िगर करने के लिए, दृश्य लेजर बॉक्स चालू करें।
उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य को दो पर और परिभाषित करने के लिए फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब सेट करें। फिर उपयुक्त लेजर को सक्रिय करें। अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, एक कपास की कली का उपयोग करने के लिए एनेस्थेटाइज्ड माउस की आंखों पर मरहम लागू करने और पेट के बाएं वेंट्रिकल क्षेत्र में एक सेंटीमीटर चीरा बनाते हैं ।
आंत के तीन से पांच सेंटीमीटर खंड को बाहरी बनाने के लिए संदंश का उपयोग करें। आंत खंड के ऊपर और नीचे दो छोटे चीरों को बनाएं और आंतों के ल्यूमेन में एक ग्लास माइक्रोपिपेट पेश करें। फिर एंटी-मेसेनेटिक साइड के साथ बाहरी आंतों के खंड को खोलने और म्यूकोसा को बेनकाब करने के लिए इलेक्ट्रो्यूटराइजेशन का उपयोग करें।
मल सामग्री को हटाने के लिए खारा समाधान के साथ संक्षेप में ऊतक कुल्ला। आंतों की म्यूकोसा सतह के धुंधला होने के लिए, उजागर म्यूकोसल सतह पर बूंदों में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के 100 माइक्रोलीटर लागू करें और दाग को पीबीएस के साथ शेष समाधान धोने से पहले तीन मिनट के लिए विकसित होने दें। इसके बाद, पीबीएस के साथ धोने से पहले तीन मिनट के इनक्यूबेशन के लिए म्यूकोसा में बूंदों में दो मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर रोडामाइन डेक्सट्रान समाधान के 100 माइक्रोलीटर लागू करें।
फिर एनेस्थेटाइज्ड माउस रीढ़ को 37 डिग्री सेल्सियस खारा के साथ धोया गया कक्ष पर चढ़कर एक कवर स्लाइड पर रखें, यदि आवश्यक हो तो स्थिति को समायोजित करें, और तैयारी को उल्टे माइक्रोस्कोप चरण पर रखें। माउस को मंच पर रखने के तुरंत बाद, प्रकाश स्रोत को चालू करें और XY स्थिति को समायोजित करें जब तक कि रोशनी अक्ष ऊतक तैयारी पर केंद्रित न हो जाए। दृष्टि के क्षेत्र का चयन करने के लिए, उपयुक्त फ़िल्टर घन का चयन करें।
शटर खोलें और आंतों के म्यूकोसा की सतह पर ध्यान केंद्रित करने के लिए मैक्रो और माइक्रो पहियों का उपयोग करें। एक क्षेत्र है जिसमें कई विली देखने के क्षेत्र के भीतर कल्पना की जा सकती है और फिल्टर घन बदलने के लिए सत्यापित करें कि रोडामाइन डेक्सट्रॉन धुंधला भी उस क्षेत्र में दिखाई दे रहा है का पता लगाने के लिए XY स्थिति को समायोजित करें । जब ब्याज के एक क्षेत्र की पहचान की गई है, छवि अधिग्रहण शुरू करने और अनुक्रम एक का चयन करने के लिए लेजर शक्ति, लाभ समायोजित, और अनुक्रम एक के लिए ऑफसेट ।
फिर अनुक्रम दो का चयन करें और लेजर शक्ति, लाभ, और अनुक्रम दो के लिए ऑफसेट समायोजित करें। जेड-स्टैक रेंज को परिभाषित करने के लिए, जेड-स्टैक ड्रॉप-ऑफ मेनू खोलें। म्यूकोसा की सतह पर ध्यान केंद्रित करने और शुरू क्लिक करने के लिए जेड-एक्सेस नियंत्रण का उपयोग करें।
जहां संकेत अभी भी पता लगाने योग्य है और अंत क्लिक की निचली सीमा पर ध्यान केंद्रित करें । जेड-स्टैक की संख्या को परिभाषित करें, लगातार दो बार अंकों के लिए दो मिनट से अधिक समय तक समय-चूक से बचें और स्टॉप तक कम से कम और प्राप्त करने के लिए समय मेनू खोलें। लाइन औसत को परिभाषित करने के लिए, एक की तलाश का चयन करें, लाइन औसत दो, दो की तलाश है, और लाइन औसत दो ।
फिर छवियों को प्राप्त करने के लिए, प्रारूप को 1024 x 1024 पिक्सल और गति को 400 तक सेट करें और स्टार्ट पर क्लिक करें। आंतों के एपिथेलियल सेल-विशिष्ट जीजीटीएस की कमी सशर्त चूहों ने गंभीर आंतों की विकृति विकसित की, जैसा कि छोटी आंत के हिस्टोलॉजिकल क्षति स्कोर में वृद्धि और मौखिक प्रशासित फिटसी-डेक्सट्रान का उपयोग करके इन-वीवो प्रयोगों में ट्रेसर के माध्यम से आंतों की एपिथेलियल पारगम्यता में वृद्धि का प्रदर्शन किया जा सकता है। सेल शेडिंग की घटनाओं को एपिथेलियल मोनोलेयर से ल्यूमेन में जाने वाली कोशिकाओं के रूप में पहचाना जा सकता है, जिससे एपिथेलियम की छत में अस्थायी अंतराल होता है जो अंततः पड़ोसी कोशिकाओं, एक तथाकथित जिपर प्रभाव के बीच संपर्क से बंद हो जाता है।
ये अंतराल नियंत्रण और GGTase कमी चूहों दोनों में मनाया जाता है, हालांकि इन घटनाओं की आवृत्ति बाद में अधिक होती है। दिलचस्प बात यह है कि अन्य कोशिकाएं भी डेक्सट्रान को तेज करती दिखाई देती हैं। ये तथाकथित पारमी सेल घटनाएं भी मुख्य रूप से सशर्त नॉकआउट चूहों में होती हैं।
इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से निर्धारित संभावित एपिथेलियल पारगम्यता अवरोधों में योगदान करने वाले विशिष्ट लक्ष्यों की पहचान करने के लिए साइटोस्केलेटन से संबंधित और तंग जंक्शन प्रोटीन का इम्यूनोशेटिंग किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग आंतों के म्यूकोसा की सतह पर अन्य घटनाओं के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जैसे कि आंतों के संक्रमण के संदर्भ में एंडोथेलियल रिसाव या प्रतिरक्षा एपिथेलियल संचार।
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