7,278 Views
•
08:55 min
•
February 27, 2020
DOI:
LarverPA er den første metode, der giver mulighed for kontinuerlig levende billeddannelse af intakt drosophila larver i mere end 10 timer med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. Denne metode bruges til at afsløre dynamiske cellulære processer af larver perifere sensoriske neuroner og til at studere mange andre cellulære processer, der sker i nærheden af larver kropsvæggen. Denne metode er nem at bruge og har mindre begrænsning på larvstørrelse.
Seks til ni larver kan monteres i billedbehandlingskammeret på samme tid, hvilket gør forsøget muligt. Billeddiagnostiske kammer på PDMS cuboids kan fremstilles med en minimal pris og kan genbruges. Denne metode er især nyttig til at studere mekanismer af dendrite udvikling og dendrite degeneration ved hjælp af drosophila larver dendritiske tilladelse neuroner.
At være i stand til at billedet den samme neuron i timevis kan afsløre, hvordan langsigtede globale ændringer af dendritiske mønstre skyldes kortsigtede adfærd på det enkelte grenniveau. Ved hjælp af PDMS cuboids, der matcher størrelsen af larver vil øge succesraten for immobiliserende larver. Find flere nyttige bånd i vores fejlfindingssektion.
Efter konstruktion af en aluminium blok fra en maskine butik, forsegle bunden af metalrammen ved hjælp af en lang dække slip med UV lim. Hærd UV-ledetråden ved hjælp af en håndholdt UV-lampe i 30 sekunder. Fastgør lag af emballagetape til den indvendige overflade af en rektangulær petriskål eller rund cellekulturplade.
Brug et lag til anden in-star larver, to lag for begyndelsen af tredje in-star larver, eller tre lag for sent tredje in-star larver. Skær båndet i ture af specifik bredde med et barberblad, 1,5 millimeter for et lag tape og to millimeter for de to lag eller tre lag tape. Efterlad mindst en fem millimeter mellemrum mellem de to strimler.
Fjern de båndlag, der dækker rummet. Fjern støv fra pladens indvendige overflade med tape. Derefter er formen klar til brug.
For at forberede PDMS mix, bland syv gram PDMS base i 0,7 gram hærdningsmiddel grundigt i en lille beholder. Beholderen sættes i en vakuumeksiccator i mindst 15 minutter for at fjerne luft fra blandingen. Langsomt hæld omkring 5,5 gram PDMS blanding på formen for at nå en en til to millimeter tykkelse.
Pdms-blandingen sættes i vakuumeksiccatoren igen i mindst 15 minutter for at fjerne de resterende luftbobler fra blandingen. Bryd de sidste par bobler med en pipettespids. Hærd PDMS på en flad overflade i en varmeinkubator ved 65 grader Celsius i to timer.
Brug derefter et barberblad til at løsne de hærdede PDMS langs kanten af formen og løsrive det fra formen. Opbevar PDMS mellem to stykker stor tape ved stuetemperatur. For tidlig og sen tredje in-star larver, skære PDMS i otte med to med en millimeter cuboids ved at placere rillen skabt af båndbåndet i midten af den lange side af kasseformen.
For anden in-star larver, skæres kasseformet til otte med en efter en millimeter. For at forberede den øverste dæksel slip til montering, skal du vælge seks PDMS cuboids med riller, der matcher størrelsen af larverne. Fjern støv fra overfladen af PDMS med tape.
Fastgør fire stykker dobbeltsidet tape på størrelse med 12 med fem millimeter på en lang dæksel slip på 22 med 50 millimeter for fastsættelse PDMS cuboids senere. Juster mellemrummene mellem de to stykker dobbeltsidet tape til det samme som bredden af PDMS-rillen. Påfør en lille dråbe UV-lim i rillen på hver PDMS-kasse, og tilsæt seks små dråber UV-lim i rummet mellem de dobbeltklæbende bånd på dækslet.
For at forberede larverne til montering, ved hjælp af et par saftæt, rense larverne i vand for at fjerne mad fra kroppens overflade. Læg de rene larver på et lille stykke fugtet silkepapir i en lille petriskål uden låg og læg den lille petriskål i en stor petriskål, der indeholder et stykke tørt silkepapir. I en kemisk hætte, bruge en plast overføre pipette til at anvende 160 til 240 mikroliter af isofluran på det tørre silkepapir og lukke låget af den store petriskål.
Vent to til tre minutter, mens du overvåger larverne. Når deres mund kroge stoppe med at bevæge sig, tage ud larverne fra den store petriskål. Placer de immobiliserede larver på UV-limen mellem de dobbeltsidede bånd på dækslet slip med dorsale neglebånd vender dækslet slip.
Dæk hver larve med en PDMS blok og passer stammen af larverne ind i rillen af PDMS. Lad larvernes hoved og hale stå uden for PDMS-rillen. Undgå at blokere larvernes spiracles ved limen.
Tryk ned på enderne af PDMS-blokken på det dobbeltsidede bånd uden at anvende kraft på rillen. Træk forsigtigt i larvens hale for at flade neglebåndet under PDMS. Brug sikkerhedsbriller og brug en håndholdt UV-lampe til at helbrede UV-limen i fire minutter på den høje indstilling.
Vend dækslet på hovedet, og brug UV-lampen til at helbrede UV-limen i yderligere fire minutter. Placer et lille stykke linsepapir med en størrelse på 15 gange 30 millimeter i bunden af billedbehandlingskammeret. Fugt papiret med 20 til 30 mikroliter vand.
Anstrækket på kammeret, så larverne vender mod indersiden af kammeret. Brug UV-limen til at klæbe begge ender af dækslet til metaloverfladen. Den dorsale side af larverne er klar til billeddannelse under et konfokal mikroskop.
Efter billeddannelse skal du fjerne olien på den øverste dækselseddel med linsepapir. Fjern topdækslet fra metalrammen ved at skære ind i rummet mellem dækslet og metalrammen med et barberblad. Billedkammeret er klar til genbrug.
Fjern PDMS-kassene fra topdækslet med spån. Rul PDMS-kassene på tape for at fjerne limrester og støv. PDMS-cuboiderne er klar til genbrug.
I denne protokol blev drosophila larver immobiliseret i mere end 10 timer til kontinuerlig billeddannelse. Dette tal viser seks sene tredje in-star larver monteret i kammeret. Larvernes stammer blev fastgjort, mens deres hoved og haler var frie til at bevæge sig.
Her demonstrerer vi anvendelsen af LarvaSPA i at studere neuronal dendrite dynamik og dendrite degeneration ved hjælp af klasse fire DA neuroner som model. For at kunne immobilisere larver ved hjælp af denne metode, er det vigtigt at stoppe udsætte larver til isofluran, når munden kroge stoppe med at bevæge sig og helbrede UV lim før larver helt vågne op. At studere dendrite degeneration og regenerering, laser skade kan udføres, når larver er immobiliseret i billeddannelse kammer.
LarverPA har hjulpet os til at forstå, hvordan dynamisk voksende dendritter undlader at innervate epidermale celler som i hepatisk celle proteoglycans og hvordan phosphatidyserin er udsat for degenererende dendritter efter laser skade. Beskyt øjnene med sikkerhedsbriller, mens UV-lampen skal bruges. Knocking ud larver ved hjælp af isofluran bør udføres i en røghætte.
Denne protokol beskriver en metode til montering af Drosophila larver for at opnå længere end 10 timer uafbrudt tid-lapse billeddannelse i intaktlevende dyr. Denne metode kan bruges til at forestille mange biologiske processer tæt på larve kroppen væggen.
Read Article
Cite this Article
Ji, H., Han, C. LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging. J. Vis. Exp. (156), e60792, doi:10.3791/60792 (2020).
Copy