Utveckling av en Larval Zebrafish Infektion Modell för Clostridioides difficile

Denna metod kan svara på den centrala frågan om den roll som medfödda immunsystemet i Clostridium infektion, som om och hur makrofager erkänna eller fagocytose denna patogen. Den största fördelen med denna metod är att den kan tillämpas på många olika anaeroba bakterier, att infektionstiden kan manipuleras, och att oral administrering representerar den normala mänskliga infektionen mycket närmare. Efter odling, överför en milliliter av kulturen till en spektrofotometer cuvette, och mäta OD600.

Överför den erforderliga mängden till ett nytt 1,5-milliliterrör för att nå en slutlig OD på en till 1,2 i en milliliter slutlig volym. Tvätta en gång med en milliliter av 1X PBS, och centrifug vid 5, 000 gånger g i tre minuter vid rumstemperatur. Resuspend i en milliliter av 1X PBS.

Tillsätt tre mikroliter av arbetslösning av det beredda fluorescerande färgämnet i en milliliter bakteriedjutningen. Inkubera provet i 15 minuter i rumstemperatur i mörker. Därefter tvättar du den färgade Clostridioides difficile en gång med 1X PBS för att avlägsna restfärgämne, och återanvända i en milliliter av 1X PBS för att uppnå en OD600 på 1,0.

Först placera en droppe på 0,8% lågsmältande agarose på zebrafisk larver i en petriskål för att täcka. Justera larverna försiktigt till ett lateralt läge. Placera petriskålen på is i 30 till 60 sekunder så att den lågsmältande agarosen kan stelna.

Lägg till 30%Danieaus medium som innehåller 0,02%till 0,04%-trikain för att täcka agaros. För att förbereda injektionslösning, tillsätt en mikroliter av 0,5%fenolrött i PBS-lösning i nio mikroliter av det färgämnesfärgade Clostridioides difficile inokulat. Ladda en kalibrerad mikroinjektionsnål med injektionslösningen med hjälp av en Microloader.

Montera den laddade nålen i en mikromanipulator, och placera den under ett stereomikroskop. Justera insprutningstrycket mellan 600 och 900 hektopascal. Ställ in injektionstiden på 0,1 till 0,3 sekunder för att få 0,5 till 1,0 nanoliter.

Ställ in nålen i mikromanipulatorn i en cirka 45 graders vinkel, som pekar mot de inbäddade larverna. Placera nålspetsen ovanför mag-tarmkanalen, nära den urogenitala poren. Pierce genom agaros, sedan muskeln med nålspetsen.

Sedan sätter in den i tarmlumen, och injicera 0,5 till 1,0 nanoliter av Clostridioides difficile. Använd ett fluorescensmikroskop för att övervaka de injicerade larverna, och använd en flexibel Microloader-spets för att plocka upp de korrekt injicerade larverna för konfokal avbildning. I en 1,5%agarosplatta med spår, placera en droppe 0,8% lågsmältande agarose på zebrafish larver att täcka.

Justera larverna försiktigt med huvudena vända upprätt i 45-graders vinklar i spåret och svansar mot väggen i spåret. Försiktigt manövrera nålen genom agarose, sedan in i munnen av zebrafish larver, genom matstrupen. När spetsen på nålen är inne i främre tarmlampan, tryck på injektionspedalen för att frigöra 0,5 till en nanoliter av bakterier kultur.

Fyll tarmens lumen. Låt det inte svämma över från matstrupen eller kloaca. Dra försiktigt tillbaka nålen från zebrafiskens mynning.

Efter sondmatning, rädda de infekterade zebrafish larverna från agarose med en flexibel Microloader spets genom att först skära agarose bort, sedan genom att lyfta larverna. Överför dessa larver till sterila 30%Danieau’s medium, och skölj två gånger. Efter att ha sövt zebrafisklarverna, tillsätt 200 till 300 mikroliter av 1%lågsmältande agarose för att täcka de sövda larverna.

Placera den infekterade regionen av larverna mot en glasrutschbana så nära som möjligt. Låt agaros stelna på is i 30 till 60 sekunder. Dränka agargen i 30%Danieaus medium som innehåller 0,02%till 0,04%trikain.

Fortsätt att avbilda larverna med ett konfokallascanningmikroskop. Efter att ha avlivat de infekterade zebrafisklarverna, sätt in en nål i dorsalstammen av zebrafisklarver nära huvudet för att immobilisera zebrafisken. Ta bort huvudet bakom gälarna med en lansett.

Sätt in en andra nål i mitten av ryggstammen. Sätt in en tredje nål i buken av zebrafisken, och dra tarmen ut ur kroppshålan. Använd en mikroinjektionsnål för att överföra 10 till 15 tarmar till ett 1,5-milliliterrör som innehåller 200 mikroliter sterila 1X PBS.

Homogenisera tarmarna med en mortelstöt för att störa vävnaden och förbereda homogenates. Se till att mortelstöten når botten av röret för att störa alla tarmar helt. I homogenatet, lägg Clostridioides difficile uppfödning medium som innehåller D-cycloserine och cefoxitin, med eller utan taurocholat, och inkubera i en anaerob kammare.

I denna studie når både neutrofiler och makrofager infektionsställena. Exemplet av en aktiverad macrophagefagocytizing två bakterier visar röjningen vid fagocytosis och matsmältning av den märkta Clostridioidesen difficile. Den microgavage att leverera fluorescens-märkt Clostridioides difficile i intestinala lumen av macrophage och neutrophil reporter linjer på fem dagar efter befruktning härmar den naturliga vägen för Clostridioides difficile infektion.

Neutrofiler och makrofager visade dock inte uppenbar migration till mag-tarmkanalen i upp till 12 timmar efter microgavage. Under tiden försvann fluorescens av den märkta Clostridioides difficile efter cirka fem timmar efter mikroförgift. Intestinala prover 24 timmar post-infektion var dissekeras och visade bakterietillväxt.

Inga bakterier växte i kontrollgruppen. Vid senare tidpunkter, inkuberade prover växte endast i det medium som innehåller TCA, vilket tyder på att totala Clostridioides difficile i tarmen hade bildat sporer. 16S rDNA PCR identifierade den odlade bakterien som Clostridioides difficile, som producerar specifika PCR-amplikoner med förutsägbar storlek runt 800 baspar.

Bakteriekulturer som odlades på en CHROMID-platta framträdde som typiska svarta kolonier, vilket ytterligare indikerade att bakterier från zebrafisktarmarna var Clostridioides difficile. Att arbeta med anaeroba bakterier kräver att de aeroba stegen hålls korta eftersom det påverkar bakteriernas biologi förstås. Medfödd immuncell i zebrafiskar kan manipuleras.

Till exempel kan de dechiffrera mekanismen för de medfödda immuncellsvaren på infektionen. Vår metod indikerade att zebrafisk kan vara ett verktyg för att studera anaerob patogen från mänsklig tarm. För att arbeta med multiresistenta patogener krävs att lämpliga säkerhetsåtgärder vidtas.