Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Visualisering og analyse af Pharyngeal Arch Arterier ved hjælp af fuld-mount Immunohistochemistry og 3D Rekonstruktion
Chapters
Summary March 31st, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi en protokol til at visualisere og analysere svælg bue arterierne 3, 4 og 6 af mus embryoner ved hjælp af hele mount immunfluorescens, væv clearing, konfokal mikroskopi, og 3D rekonstruktion.
Transcript
Denne metode gør det muligt at opdele hver svælalsbue. Endotelcelletal kan derefter kvantificeres i hver bue som et middel til at studere svælalsk arch arterie udvikling. De vigtigste fordele ved denne tilgang er evnen til at visualisere forholdet mellem forskellige vaskulære strukturer og evnen til kvantitativt at bestemme, hvordan strukturerne påvirkede mutanter.
Aorta arch arterier er almindeligt muteret i medfødt hjertesygdom. Vores metode gør det muligt at undersøge, hvordan mutationer ændrer den fysiologiske proces med kardannelse og remodeling. Selv om vi bruger denne metode til at få indsigt i mekanismerne i medfødt hjertesygdom, kan det anvendes på andre systemer, især med fremkomsten af lys-ark mikroskopi.
Begynd med at bruge en glaspipette til at overføre hver museembryonsdag 9,5 eller 10,5 embryo til individuelle to milliliterrør, der indeholder en milliliter PBS. Efter fiksering, bruge fine kraftforladelser til omhyggeligt klemme fosteret lige over bagben og foretage en tværgående snit til at fjerne den bageste halvdel af fosteret. For at gennemtrænge embryonerne skal PBS erstattes med PBSt og embryonerne sættes på fire grader Celsius med let omrøring natten over.
Den næste dag, erstatte PBST med 600 mikroliter af blokering buffer uden at røre embryoner for en 16 til 18-timers inkubation ved fire grader Celsius med blid omrøring. Den næste morgen, erstatte blokering buffer med 600 mikroliter af den primære antistof af interesse pr rør for en fire til fem-dages inkubation ved fire grader Celsius med blid omrøring. Ved inkubationens afslutning vaskes embryonerne i en milliliter PBST i fire til fem timer med forsigtig omrøring ved stuetemperatur, der ændrer PBS hver time, efterfulgt af en natskuvning i frisk PBST ved fire grader Celsius, og fire til fem yderligere en times vasker den næste dag.
Efter den sidste vask udskiftes PBST i hvert rør med 600 mikroliter af den passende sekundære antistofopløsning til en fire til fem dages inkubation ved fire grader Celsius. Ved inkubationens afslutning vaskes embryonerne i en milliliter frisk PBST pr. vask som netop påvist, og der skal anvendes en glaspipette til forsigtigt at overføre hvert embryon til individuelle paraffinforme af plast. Fjern forsigtigt pbst fra omkring hvert foster og orientere hvert foster i en sagittal position.
Derefter hurtigt tilføje omkring 500 mikroliter af varm agarose til hver form, indtil hvert foster er lige dækket og placere forme på is dækket med aluminiumsfolie, indtil agarose har størknet. Ved dehydrering af embryonale prøver anvendes en ren skalpel til at skære en agaroseblok omkring hvert embryon og bruge kraftbefæstelse til at gribe agarosen til overførsel til et mærket to milliliterrør indeholdende en milliliter 25 % methanol. Efter en times inkubation med blid omrøring i mørke erstattes 25%methanol med en milliliter 50% methanol pr. rør for yderligere en times inkubation i mørke.
Efter afslutningen af dehydrering, erstatte 100% methanol med en milliliter på 50%BABB for en times inkubation med blid omrøring i mørke. Ved inkubationens afslutning erstattes 50%BABB med en milliliter 100%BABB pr. rør for en times inkubation med let omrøring i mørke efterfulgt af endnu en inkubation med 100%BABB som netop påvist. For at montere embryoner til billeddannelse, fjerne limen fra en hurtig brønd kofanger og placere kofangeren på en 24 med seks milliliter nummer 1,5 glas coverslip.
Påfør let tryk på limen for at fjerne eventuelle luftbobler mellem dækslækagen og kofangeren og kassér forsigtigt 100%BABB fra hvert rør. Brug derefter fine kraftbefædre til forsigtigt at overføre fosteret til hurtigtebne uden at røre ved embryonet og placere en anden dækslæd på kofangeren. At overfladen endotel i hele tredje svælds bue, åbne billedet af interesse i softwaren og klik tilføje ny overflade.
Dobbeltklik på overfladen et, og omdøb den nye overflade til tredje svældsbue. Vælg spring automatisk oprettelse over, rediger manuelt, og indstil overfladeretningen til YZ-planet. Brug skivepositionen til at placere det tredje svælgbuefladeplan, hvor den tredje PAA og dorsal aorta forbindes.
Roter billedet, så det tredje svælgbuefladeplan er i betragtning, og sluk for ortoskisereværktøjet. Vælg funktionen afstandstegningstilstand under tegnekonturtilstand, og juster parameterindstillingerne efter behov. Når alle parametrene er indstillet, skal du trykke på Escape-tasten og klikke på draw for at spore omkredsen af den tredje svællede bue med musemarkøren.
Brug derefter skiven position til at flytte 10 til 25 skiver og spore omkredsen af svælds bue. Når hele buen er blevet sporet, skal du klikke på opret overflade for at generere overfladen af det sporede område. Vælg maskemarkering for den tredje PAA og DAPI i redigeringsmenuen for at skjule de overfladestrukturer, og klik på OK. Omdøb derefter den nye kanal som PAA DAPI.
Gentag dette trin for de resterende kanaler. Hvis du vil visualisere endotelplexus separat fra PAA, skal du vælge maskemarkering for den tredje PAA og vælge DAPI. Fjern markeringen vælge voxels udvendige overflade til og kontrollere vælge voxels inde overflade til.
Indstil vælge voxels inde i overfladen til nul og klik på OK. Omdøb den nye kanal som ikke-PAA DAPI. Gentag dette trin for de resterende kanaler. Vælg maskevalg for den tredje pa, og vælg ikke-PAA DAPI, og klik på OK. Omdøb den nye kanal som plexus DAPI.
Gentag dette trin for de resterende kanaler. Hvis du vil kvantificere de enkelte endotelceller inden for hver interessestruktur, skal du i panelet med justering af skærmen slukke for alle kanaler undtagen PAA ERG-kanalen. Klik på Tilføj nye pletter under genvejsmenuen, og klik for at omdøbe pletter ét samlet antal endotelceller.
Klik på den blå pil, og vælg PAA ERG-kanalen for kildekanalen. Juster den anslåede XY-diameter til fire mikrometer, og klik på den blå pil for at fortsætte til næste panel. Brug glideskalaen til at justere antallet af pletter for at sikre, at hver ERG-positiv endotelcellekerne repræsenteres af ét sted.
Klik derefter på den grønne dobbeltpil, og sluk for PAA ERG-kanalen i panelet til justering af skærmen. Slå PAA VEGFR2-kanalen til for at visualisere PAA-endothelet og klikke på rediger og tilføj/slet for at markere objektoverfladen. Tryk derefter på Escape og hold Skift nede for at slette eventuelle pletter, der ikke er VEGFR2-positive, og klik på fanen Statistik for at bestemme det samlede antal endotelceller.
Hele mount immunfluorescens producerer klare og rene resultater giver mulighed for 3D rekonstruktion af svælg bue endotel. I dette billede er tilstedeværelsen af de store lyse prikker resultatet af partikler i enten antistof- eller blokeringsbufferopløsningerne. Efter svælget bue og PAA overflade farvning, brug af masken funktion gør det muligt for overfladeområder, der skal visuelt adskilt og uafhængigt analyseret.
Maskering giver også mulighed for individuel analyse og kvantificering af endotelcellenumre i hver struktur. Her blev spotfunktionen for eksempel brugt til at kvantificere det samlede antal endotelceller i både PAA og plexus ved at tildele et enkelt sted for hver kerne, der udtrykker ERG. I dette billede kan der observeres et ERG-positivt VEGFR2 negativt punkt, der er genereret af spotfunktionen.
Derfor er det vigtigt at kontrollere, at hver prik, der genkendes af softwaren, rent faktisk repræsenterer en enkelt endotelcelle. For at opnå rene og klare billeder skal du huske at dreje alle opløsninger ned og vaske hvert foster grundigt efter antistofinkubationer. Det er vigtigt at huske, at BABB er ætsende og giftigt.
Håndter og kassér opløsningsmidlet korrekt, og sørg for at forsegle de smeltede embryoner helt for at forhindre BABB-lækage.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
