Developmental Biology
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पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके Pharyngeal आर्क धमनियों का दृश्य और विश्लेषण
Chapters
Summary March 31st, 2020
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यहां, हम पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, ऊतक समाशोधन, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके फैरिंगियल आर्क धमनियों 3, 4 और माउस भ्रूण के 6 की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Transcript
यह विधि प्रत्येक फरेंगल आर्क को विभाजित करने की अनुमति देती है। एंडोथेलियल सेल संख्या को प्रत्येक आर्क में फरेंगल आर्क धमनी विकास का अध्ययन करने के साधन के रूप में निर्धारित किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण के मुख्य फायदे विभिन्न संवहनी संरचनाओं के बीच संबंधों की कल्पना करने की क्षमता और मात्रात्मक रूप से यह निर्धारित करने की क्षमता है कि संरचनाओं ने म्यूटेंट को कैसे प्रभावित किया।
महाधमनी आर्क धमनियों आमतौर पर जन्मजात हृदय रोग में उत्परिवर्तित कर रहे हैं। हमारी विधि कैसे उत्परिवर्तन पोत गठन और रीमॉडलिंग की शारीरिक प्रक्रिया को बदलने के अध्ययन की अनुमति देता है । यद्यपि हम जन्मजात हृदय रोग के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इस विधि का उपयोग करते हैं, इसे विशेष रूप से प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी के आगमन के साथ अन्य प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है।
प्रत्येक माउस भ्रूण दिवस 9.5 या 10.5 भ्रूण को पीबीएस के एक मिलीलीटर वाले व्यक्तिगत दो मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करके शुरू करें। निर्धारण के बाद, हिंडलिम्ब के ठीक ऊपर भ्रूण को ध्यान से चुटकी लेने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें और भ्रूण के पीछे के आधे हिस्से को हटाने के लिए एक ट्रांसवर्स कट बनाएं। भ्रूण को पार करने के लिए, पीबीएसटी के साथ पीबीएस की जगह और कोमल आंदोलन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण रात भर जगह है ।
अगले दिन, पीबीएसटी को कोमल आंदोलन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर 16 से 18 घंटे के इनक्यूबेशन के लिए भ्रूण को छूने के बिना बफर को अवरुद्ध करने के ६०० माइक्रोलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें । अगली सुबह, एक चार से पांच दिन के लिए प्रति ट्यूब ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के ६०० माइक्रोलीटर के साथ अवरुद्ध बफर की जगह कोमल आंदोलन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन । इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएसटी के एक मिलीलीटर में भ्रूण को चार से पांच घंटे के लिए धोएं कमरे के तापमान पर कोमल आंदोलन के साथ पीबीएस हर घंटे बदल रहा है, इसके बाद ताजा पीबीएसटी में एक रात की इनक्यूबेशन चार डिग्री सेल्सियस और चार से पांच अतिरिक्त एक घंटे की धोती अगले दिन ।
अंतिम धोने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में पीबीएसटी को चार डिग्री सेल्सियस पर चार से पांच दिन के इनक्यूबेशन के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 600 माइक्रोलीटर के साथ बदलें। इनक्यूबेशन के अंत में, सिर्फ प्रदर्शन के रूप में धोने के प्रति ताजा PBST के एक मिलीलीटर में भ्रूण धोने और धीरे अलग प्लास्टिक पैराफिन मोल्डों में प्रत्येक भ्रूण हस्तांतरण के लिए एक गिलास पिपेट का उपयोग करें । ध्यान से प्रत्येक भ्रूण के आसपास से किसी भी PBST को हटा दें और एक sagittal स्थिति में प्रत्येक भ्रूण उन्मुख ।
फिर जल्दी से प्रत्येक मोल्ड में गर्म एगर उठे के बारे में 500 माइक्रोलीटर जोड़ें जब तक कि प्रत्येक भ्रूण को कवर नहीं किया जाता है और एल्यूमीनियम पन्नी से ढके बर्फ पर मोल्डों को तब तक रखें जब तक कि एगर उठे जम न जाएं। भ्रूण के नमूनों के निर्जलीकरण के लिए, प्रत्येक भ्रूण के चारों ओर agarose के एक ब्लॉक में कटौती करने के लिए एक साफ स्केलपेल का उपयोग करें और 25% मेथनॉल के एक मिलीलीटर युक्त एक लेबल दो मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरण के लिए agarose समझ करने के लिए संदंश का उपयोग करें । अंधेरे में कोमल आंदोलन के साथ एक घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, अंधेरे में एक घंटे की इनक्यूबेशन के लिए प्रति ट्यूब 50% मेथनॉल के एक मिलीलीटर के साथ 25% मेथनॉल की जगह लें।
निर्जलीकरण की समाप्ति के बाद, अंधेरे में कोमल आंदोलन के साथ एक घंटे के इनक्यूबेशन के लिए 50% BABB के एक मिलीलीटर के साथ 100% मेथनॉल को बदलें। इनक्यूबेशन के अंत में, अंधेरे में कोमल आंदोलन के साथ एक घंटे की इनक्यूबेशन के लिए प्रति ट्यूब 100% BABB के एक मिलीलीटर के साथ 50% BABB की जगह, 100% BABB के साथ एक दूसरे इनक्यूबेशन के बाद के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया। इमेजिंग के लिए भ्रूण माउंट करने के लिए, एक तेजी से अच्छी तरह से बम्पर से चिपकने वाला हटा दें और छह मिलीलीटर संख्या १.५ ग्लास कवरलिप द्वारा एक 24 पर बंपर जगह है ।
कवरस्लिप और बंपर के बीच किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए चिपकने वाले पर कोमल दबाव लागू करें और प्रत्येक ट्यूब से 100% BABB को ध्यान से त्यागें। फिर भ्रूण को छूने के बिना तेजी से अच्छी तरह से भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें और बंपर पर एक दूसरे कवरस्लिप रखें। पूरे तीसरे फरेन्जील आर्क में एंडोथेलियम को सतह पर लाने के लिए, सॉफ्टवेयर में रुचि की छवि को खोलें और नई सतह जोड़ने पर क्लिक करें।
डबल-क्लिक सतह एक और तीसरी pharyngeal चाप करने के लिए नई सतह का नाम बदलें। स्वचालित निर्माण को छोड़ें, मैन्युअल रूप से संपादित करें, और सतह अभिविन्यास को वाईजेड विमान में सेट करें। तीसरे पीएचए और पृष्ठीय महाधमनी कनेक्ट करने के लिए तीसरे pharyngeal आर्क सतह विमान जगह करने के लिए टुकड़ा स्थिति का प्रयोग करें ।
छवि को घुमाएं ताकि तीसरा फरेन्गल आर्क सरफेस प्लेन देखने में हो और ऑर्थो स्लाइसर को बंद कर दे। ड्रा कंटूर मोड के तहत, डिस्टेंस ड्राइंग मोड फंक्शन का चयन करें और पैरामीटर सेटिंग्स को आवश्यक के रूप में समायोजित करें। जब सभी पैरामीटर सेट किए गए हों, तो माउस कर्सर के साथ तीसरे फरेंगल आर्क की परिधि का पता लगाने के लिए एस्केप कुंजी दबाएं और ड्रा पर क्लिक करें।
फिर स्लाइस स्थिति का उपयोग 10 से 25 स्लाइस स्थानांतरित करने के लिए और pharyngeal आर्क की परिधि का पता लगाने के लिए। जब पूरे आर्क का पता लगाया गया है, तो खोज क्षेत्र की सतह उत्पन्न करने के लिए सतह बनाने पर क्लिक करें। सामने आई संरचनाओं की मास्किंग के लिए, एडिट मेनू में, तीसरे पीएए और डीएपीआई के लिए मुखौटा चयन का चयन करें और ओके पर क्लिक करें। फिर नए चैनल का नाम बदलकर पीएए दापी कर लें।
शेष चैनलों के लिए इस कदम को दोहराएं। पीए से अलग एंडोथेलियल प्लेक्सस की कल्पना करने के लिए, तीसरे पीएए के लिए मुखौटा चयन का चयन करें और DAPI का चयन करें। अनियंत्रित सतह के बाहर स्वर का चयन करें और सतह के अंदर चुनिंदा स्वरों की जांच करें।
सतह के अंदर स्वरों को शून्य पर सेट करें और ओके पर क्लिक करें। नए चैनल का नाम बदलकर गैर-पा डीएपीआई करें। शेष चैनलों के लिए इस कदम को दोहराएं। तीसरे पीए के लिए मास्क चयन का चयन करें और गैर-PAA DAPI का चयन करें और ओके पर क्लिक करें। नए चैनल का नाम बदलकर प्लेक्सस डीएपीआई करें।
शेष चैनलों के लिए इस कदम को दोहराएं। डिस्प्ले एडजस्टमेंट पैनल में रुचि की प्रत्येक संरचना के भीतर व्यक्तिगत एंडोथेलियल कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पीएए ईआरजी चैनल को छोड़कर सभी चैनलों को बंद कर दें। गुण मेनू के तहत, नए स्पॉट जोड़ने पर क्लिक करें और एंडोथेलियल कोशिकाओं की एक PAA कुल संख्या स्थानों का नाम बदलने के लिए क्लिक करें ।
नीले तीर पर क्लिक करें और स्रोत चैनल के लिए PAA ERG चैनल का चयन करें। अनुमानित XY व्यास को चार माइक्रोमीटर में समायोजित करें और अगले पैनल में आगे बढ़ने के लिए नीले तीर पर क्लिक करें। यह सुनिश्चित करने के लिए स्पॉट की संख्या को समायोजित करने के लिए स्लाइडिंग स्केल का उपयोग करें कि प्रत्येक ईआरजी सकारात्मक एंडोथेलियल सेल नाभिक का प्रतिनिधित्व एक स्थान द्वारा किया जाता है।
इसके बाद, हरे रंग के डबल एरो पर क्लिक करें और डिस्प्ले एडजस्टमेंट पैनल में पीएए ईआरजी चैनल बंद कर दें। PAA endothelium कल्पना और वस्तु की सतह का चयन करने के लिए संपादित करें और जोड़ने/हटाने पर क्लिक करें करने के लिए PAA VEGFR2 चैनल पर बारी है । फिर एस्केप दबाएं और किसी भी स्पॉट को हटाने के लिए शिफ्ट को दबाएं जो VEGFR2 सकारात्मक नहीं हैं और एंडोथेलियल कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए सांख्यिकी टैब पर क्लिक करें।
पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्पष्ट और स्वच्छ परिणाम पैदा करता है जो फरेंगल आर्क एंडोथेलियम के 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति देता है। इस छवि में, बड़े उज्ज्वल बिंदुओं की उपस्थिति या तो एंटीबॉडी में कण का परिणाम है या बफर समाधान अवरुद्ध है। फरेंगल आर्क और पीएए सतह धुंधला होने के बाद, मुखौटा फ़ंक्शन का उपयोग सामने आए क्षेत्रों को नेत्रहीन रूप से अलग और स्वतंत्र रूप से विश्लेषण करने की अनुमति देता है।
मास्किंग प्रत्येक संरचना के भीतर एंडोथेलियल सेल नंबरों के व्यक्तिगत विश्लेषण और मात्राकरण की भी अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, यहां स्पॉट फीचर का उपयोग ईआरजी व्यक्त करने वाले प्रत्येक नाभिक के लिए एक ही स्थान निर्दिष्ट करके पीएए और प्लेक्सस दोनों में एंडोथेलियल कोशिकाओं की कुल संख्या को निर्धारित करने के लिए किया गया था । इस छवि में, स्पॉट फ़ंक्शन द्वारा उत्पन्न किए गए ईआरजी पॉजिटिव VEGFR2 नकारात्मक स्थान को देखा जा सकता है।
इसलिए, यह सत्यापित करना आवश्यक है कि सॉफ्टवेयर द्वारा मान्यता प्राप्त प्रत्येक डॉट वास्तव में एक ही एंडोथेलियल सेल का प्रतिनिधित्व करता है। स्वच्छ और स्पष्ट छवियों को प्राप्त करने के लिए, सभी समाधानों को स्पिन करना और एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद प्रत्येक भ्रूण को ठीक से और अच्छी तरह से धोना याद रखें। यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि BABB संक्षारक और विषाक्त है।
सॉल्वेंट को ठीक से संभालें और त्यागें और बबल रिसाव को रोकने के लिए पिघले हुए भ्रूण को पूरी तरह से सील करना सुनिश्चित करें।
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