Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Brug af en ekstracellulær flux analysator til at måle ændringer i Glycolyse og oxidativ fosforylering under mus Sædcapacitation
Chapters
Summary January 22nd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver anvendelsen af en ekstracellulær flux analysator til at overvåge real-time ændringer i glycolyse og oxidativ fosforylering under mus sperm capacitation.
Transcript
Denne protokol kan bruges til at anvende en ekstracellulær flux analysator til at overvåge ændringer i energimetabolisme under sperm kapacitans. Vi udviklede denne protokol for at sammenligne ændringer i glykolyse og oxidativ fosforylering i realtid mellem ikke-kapaciteret og kapaciteret museceller. Dagen før analysen skal du fjerne sensorpatronen fra et ekstracellulært fluxanalysesæt og placere patronen på hovedet ved siden af bryggerpladen.
Fyld en opløsning reservoir med 25 milliliter dobbelt destilleret vand og tilsæt 200 mikroliter vand til hver brønd af utility plade, derefter placere sensoren patron tilbage i utility plade. Placer pladen i en 37 grader Celsius ikke-kuldioxid inkubator. Dernæst aliquot 25 milliliter ekstracellulære flux analysator kalibrant i en 50 milliliter konisk rør og placere røret i 37 grader Celsius ikke-kuldioxid inkubator.
For at forberede ConA belagte mikroplader opløses 2,5 milligram ConA i fem milliliter dobbeltdestilleret vand og brug en multikanalpipette til at fylde hver brønd af en ekstracellulær fluxanalysator 96-brøndplade med 50 mikroliter af ConA-opløsningen, og lad derefter låget stå åbent for at lade pladen tørre natten over. For at forberede sædbufferen opvarmes 250 milliliter ekstracellulær fluxanalysator TYH buffer til 37 grader Celsius og justere pH-zonen til 7,4. På analysedagen skal du udskifte vandet i hver brønd på brugspladen med 200 mikroliter XF calibrant pr. brønd og placere pladen tilbage i den ikke-kuldioxidinkubøse i mindst en time.
Hvis du vil generere en bølgeskabelon, skal du aktivere den ekstracellulære fluxanalysator. Mens temperaturen er ved at stabilisere sig til 37 grader Celsius, åbne bølge software og åbne en tom skabelon. Under fanen gruppedefinitioner skal analysemediet defineres som TYH og celletypen som musesæd, så injektionsstrategierne og forbehandlingerne efterlades tomme.
Opret forskellige grupper for hver analysetilstand, og åbn pladekortet for at tildele hver gruppe til bestemte brønde. Under protokolfanen skal du fremhæve jævnpunktsudligning af lys, tilføje hver af fire forskellige målecyklusser, vælge den respektive port og redigere måledetaljerne, så målingen efter injektion er fremhævet, derefter gemme analyseskabelonen, udfylde projektoversigten og gemme resultaterne. Før høst af sædceller, prewarm 50 milliliter TYH buffer ved 37 grader Celsius.
Efter høst caudas fra voksne mandlige mus, placere hver cauda i 500 mikroliter af den forvarmte TYH buffer i individuelle brønde af en 24-brønd plade. Brug snævler til at immobilisere hver cauda individuelt i bunden af hver brønd og hurtigt gøre fem til syv små snit i hvert væv ved hjælp af fjer saks. Når alle caudaerne er blevet skåret ind, skal pladen straks anbringes i den ikke-kuldioxidinkubator, så sæden kan spredes i 15 minutter.
Hvis du vil ilægge sensorpatronen, skal du fjerne låget fra sensorpatronen og justere bogstavet i den pågældende portindlæsningsvejledning med patronens øverste venstre hjørne. Hold portbelastningsvejledningen på plads, sæt pipettenslyfferne lodret ind i portbelastningsstyrehullerne i port A, og indsprøjt 20 mikroliter TYH-buffer i hver kolonne. For port B injiceres 22 mikroliter TYH-buffer i kolonnerne en til fire, 22 mikroliter på 500 millimolar 2-deoxyglucose i kolonner fem til otte og 25 mikroliter af fem mikromolarantimycin En rotenon i søjle ni til 12.
I port C skal der injiceres 25 mikroliter TYH-buffer i hver kolonne med ulige tal og 25 mikroliter på 10 millimolar dibutyrylcyklisk AMP 500 mikromolar IBMX i hver kolonne med lige tal, og anbring derefter sensorpatronen med en kalibreringsplade i den ekstracellulære fluxanalysator og start analysen. Kalibreringen tager 10 til 15 minutter. For at forberede sædpladerne tilsættes tre milliliter på tre milligram pr. milliliter kvægserumalbumin i TYH-buffer til hver af de fem fem millilitercentrifugerør.
Dernæst pool to brønde af sæd i hver af tre 1,5 milliliter centrifuge rør. Efter optælling fortyndes sæden til to gange 10 til koncentrationen af syv sædceller pr. milliliter pr. prøve i frisk TYH suppleret med kvægserumalbumin. Sediment sædcellerne ved centrifugering og resuspenderede sædpiller i en milliliter TYH buffer.
Centrifuge sæden igen og fjerne supernatanter passe på ikke at forstyrre pellets. Hver sædsuspension overføres til et af de forberedte fem millilitercentrifugerør, og der tilsættes 180 mikroliter TYH-buffer i hver hjørnebly af en ConA-belagt plade. Der tilsættes 180 mikroliter sæd i hver tom brønd på ConA-belagt plade, og pladen centrifugeres to gange og roterer pladen 180 grader mellem centrifugeringer, og anbring derefter kalibreringspladen med sædpladen, og fortsæt analysen.
I dette repræsentative eksperiment blev sædceller kapaciteret ved tilstedeværelse af glukose som det eneste energiunderlag og 2-deoxyglucose og antimycin og rotenon som farmakologiske modulatorer. Pilen angiver induktion af kapacitans. Ved tilstedeværelse af glukose blev kapacitans ledsaget af en syvdobling af den ekstracellulære forsuringshastighed, som hæmmes ved at blokere glykolyse med 2-deoxyglucose.
Kapaciteret sædceller viste en 20-dobling af iltforbruget sammenlignet med ikke-kapaciteret sædceller, der viser, at musecellerne øger både glykolyse og oxidativ fosforylering for at understøtte den stigende energiefterspørgsel under kapacitansation. Stigningen i den ekstracellulære forsuringshastighed under sperm kapacitansation påvirkes ikke af de oxidative fosforyleringshæmmere antimycin A og rotenone, hvilket indikerer, at ændringen i denne hastighed hovedsagelig er drevet af hydrogenudsætning fra glykolyse. Stigningen i iltforbruget er imidlertid blokeret af antimycin A og rotenon samt af 2-deoxyglucose, der afslører, at stigningen i OXPHOS under sperm kapacitans er afhængig af glykolytisk aktivitet.
Energikilden og de farmakologiske aktivatorer og inhibitorer kan varieres afhængigt af forsøgets mål, og op til 12 forskellige betingelser kan måles parallelt. Protokollen kan let tilpasses andre arter som mennesker eller kvæg, hvor ændringerne i energimetabolismen under kapacitans er lige så gådefulde.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
