Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
सी2C12 Myoblast सेल लाइन में एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन एन्कोडिंग जीन का स्थिर नॉकडाउन छोटे हेयरपिन (एसएच) आरएनए का उपयोग कर
Chapters
Summary February 12th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
हम छोटे हेयरपिन (श) आरएनए का उपयोग करके C2C12 मायोब्लास्ट में एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन को स्थिर रूप से नीचे गिराने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। एक उदाहरण के रूप में ADAMTSL2 को लक्षित करते हुए, हम C2C12 myoblast के दौरान mRNA, प्रोटीन और सेलुलर स्तर पर नॉकडाउन दक्षता के सत्यापन के तरीकों का वर्णन मायोट्यूब भेदभाव के लिए ।
Transcript
यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह हमें प्रोटीन के कार्य का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जैसे कि एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन, जो मायोट्यूब गठन या परिपक्वता के बाद के चरणों में उप-विनियमित हैं। इस विधि का उपयोग विशिष्ट शर्ना और फेनोटाइपिंग के लिए संबंधित विश्लेषणात्मक उपकरणों का उपयोग करके C2C12 कोशिकाओं में रुचि के किसी भी जीन को नीचे गिराने के लिए किया जा सकता है। इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि हमने C2C12 कोशिकाओं को उत्पन्न किया है जो परिपक्व मायोट्यूब में भी हमारे ब्याज के जीन को लगातार दबा सकते हैं।
इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण पहलू अविभेदित राज्य में C2C12 कोशिकाओं को बनाए रखना है, जिसका अर्थ नियमित सेल संस्कृति के दौरान कम सेल घनत्व पर है। ट्रांसफैक्शन से पहले दिन, बीज पांच बार 10 प्रति मिलीलीटर चौथे C2C12 कोशिकाओं को एक छह अच्छी तरह से थाली में प्रति अच्छी तरह से पूरा DMEM के दो मिलीलीटर में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर रात भर इनक्यूबेशन के बाद एक ४० से ५०% संगम प्राप्त करने के लिए । अगली सुबह, 25 मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड के १०० माइक्रोलीटर को एक १.५-मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब प्रति संस्कृति में अच्छी तरह से २५.५ माइक्रोलीटर पी स्टॉक समाधान के साथ एक पांच मिनट के इनक्यूबेशन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर जोड़ते हैं ।
इसके बाद, ३७ डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट की इनक्यूबेशन के लिए संस्कृति प्रति 25-मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड के १०० माइक्रोलीटर के साथ प्लाज्मिड डीएनए के तीन माइक्रोग्राम को मिलाएं । ऊष्मायन के अंत में, प्रत्येक पतला पीई रिएजेंट की पूरी मात्रा को 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए कोमल पिपिंग के साथ प्रत्येक पतला प्लाज्मिड समाधान के साथ मिलाएं। इनक्यूबेशन के दौरान, एंटीबायोटिक दवाओं या सीरम के बिना DMEM के साथ C2C12 सेल संस्कृतियों के supernatants की जगह ।
इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक ट्रांसफैक्शन मिश्रण की पूरी मात्रा को बूंदों में प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें, जबकि लगातार सेल कल्चर डिश को आगे बढ़ाते हैं। सेल कल्चर इनक्यूबेटर में छह घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं में माध्यम को पूर्ण डीएमईएम के साथ बदलें। ट्रांसफैक्शन के 24 घंटे बाद, प्रत्येक कुएं में पूर्ण डीएमईएम को चयन माध्यम के साथ बदलें, जो प्यूरोमाइसिन के पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक है, और कोशिकाओं को 10 से 14 दिनों के लिए या जब तक स्थिर C2C12 कोशिकाओं को देखा जाता है तब तक कोशिकाओं को वापस करें।
फिर प्यूरोमाइसिन के प्रति मिलीलीटर पांच माइक्रोग्राम की उपस्थिति में कम सेल घनत्व संस्कृतियों में प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं का विस्तार करें, और भविष्य के उपयोग के लिए कोशिकाओं की छह से 10 शीशियों को क्रायोप्रिजर्वर्व करते हैं। भेदभाव के लिए C2C12 कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, बीज १.५ बार 10 पांचवें स्थिर puromycin प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं के लिए चयन माध्यम के एक मिलीलीटर में अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली में, और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट जब तक संस्कृतियों ९५% भंघन कर रहे हैं । भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, एक कैमरे से लैस एक उल्टे उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर मायोट्यूब गठन के बाद हर दो दिनों में सीरम-मुक्त डीएमईएम के साथ प्रत्येक कुएं में माध्यम को बदलें।
विभेदित कोशिकाओं के मायोसिन भारी श्रृंखला इम्यूनोस्टेटिंग के लिए, आठ-अच्छी कक्ष स्लाइड पर पूर्ण डीएमईएम प्रति कक्ष के 500 माइक्रोलीटर में चौथे प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं को पांच गुना बीज, और कोशिकाओं को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें। जब कोशिकाएं 95% तक पहुंचती हैं, तो प्रत्येक कुएं में चयन माध्यम को सीरम-मुक्त डीएमईएम के 500 माइक्रोलीटर के साथ बदलें। उपयुक्त प्रायोगिक समय बिंदुओं पर, पीबीएस प्रति पीबीएस के 5 मिलीलीटर प्रति धोने के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से तीन बार में अंतर कोशिकाओं को कुल्ला करना पीबीएस में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के 200 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को ठीक करने से पहले अच्छी तरह से।
15 मिनट के बाद, कोशिकाओं को प्रति वॉश ताजा पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, जैसा कि पांच मिनट के लिए पीबीएस में 5-मोलर ग्लाइसिन के 200 माइक्रोलीटर के साथ इनक्यूबेशन के बाद प्रदर्शित किया गया है। इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएस में 1% गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट के 200 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को 10 मिनट तक पार करने से पहले कोशिकाओं को तीन बार धोएं। इसके बाद, पीबीएस में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 200 माइक्रोलीटर के साथ गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों को एक घंटे के लिए ब्लॉक करें और इसके बाद पीबीएस में तीन वॉश करें।
अंतिम धोने के बाद, कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए मायोसिन भारी श्रृंखला एंटीबॉडी के 200 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को लेबल करें। तीन पीबीएस वॉश के बाद, कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित। तीन अंतिम धोता के बाद, पीबीएस को एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं को दापी और एक कवरस्लिप के साथ पूरक बढ़ते मध्यम की एक बूंद के साथ माउंट करें।
फिर उपयुक्त फ़िल्टर सेट का उपयोग करके फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर प्रत्येक कक्ष का निरीक्षण करें। पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा सेल संस्कृतियों में नॉकडाउन दक्षता का आकलन करने के लिए, पहले बीज तीन बार 10 पांचवें प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं को एक छह अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से पूर्ण DMEM के दो मिलीलीटर में । 24 घंटे के बाद, पीबीएस के साथ संस्कृतियों को कुल्ला, और प्रदर्शन के रूप में सीरम मुक्त DMEM के दो मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं के भेदभाव शुरू करते हैं ।
उपयुक्त प्रायोगिक समय बिंदुओं पर स्रावित प्रोटीन के विश्लेषण के लिए, प्रत्येक कुएं से सीरम-मुक्त वातानुकूलित माध्यम का एक मिलीलीटर अपकेंद्रित्र के लिए व्यक्तिगत 1.5-मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में एकत्र करें। अपकेंद्रित्र के बाद, वातानुकूलित मध्यम सुपरनेटेंट के एक मिलीलीटर को नए 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और प्रोटीन को गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट प्रति ट्यूब में ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड के 391 माइक्रोलीटर के साथ उपजी करें। 30 सेकंड के भंवर के बाद, मिश्रण को 10 मिनट तक बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा उपजी प्रोटीन को गोली दें, और प्रोटीन छर्रों को ताजा बर्फ-ठंडे एसीटोन और प्रति धोने के साथ तीन बार धोएं। अंतिम धोने के बाद, एसडीएस-पेज नमूना बफर प्रति ट्यूब के 50 माइक्रोलीटर में पुनर्पिति होने से पहले कमरे के तापमान पर तीन से चार मिनट के लिए छर्रों को हवा-सूखा। फिर मानक प्रोटोकॉल के अनुसार पश्चिमी दाग विश्लेषण से पहले ९५ डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए नमूनों को उबालें ।
इंट्रासेलुलर और झिल्ली से बंधे प्रोटीन विश्लेषण के लिए, प्रत्येक में कोशिका परत को अच्छी तरह से पीबीएस के दो मिलीलीटर के साथ कुल्ला करें, और पीबीएस के एक मिलीलीटर मात्रा में कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक उखाड़ फेंकने के लिए एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। अपकेंद्रित्र के लिए कोशिकाओं को व्यक्तिगत 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें और इसके बाद अपकेंद्रित्र के माध्यम से प्रति ट्यूब पीबीएस के एक मिलीलीटर में तीन धोएं। अंतिम धोने के बाद, लाइसिस बफर के 200 माइक्रोलीटर में सेल छर्रों को बर्फ पर 30 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए EDTA-मुक्त प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल रिएजेंट के साथ पूरक किया जाता है।
इनक्यूबेशन के अंत में, 23 किलोहर्ट्ज की ऑपरेटिंग फ्रीक्वेंसी पर 10 की पावर आउटपुट सेटिंग के साथ बर्फ पर 15 सेकंड के लिए नमूनों को अल्ट्रासोनिकेट करें, और अपकेंद्रित्र द्वारा सेल मलबे को हटा दें। सुपरनेटैंट्स को नए 1.5-मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब में स्थानांतरित करें, और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करें। प्रति सैंपल 60 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में 5X SDS-पेज सैंपल बफर के साथ 100 माइक्रोग्राम प्रोटीन मिलाएं और नमूनों को 95 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए उबालें।
फिर वांछित लक्ष्य प्रोटीन की उपस्थिति के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें। प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं का चयन गैर-प्रतिरोधी कोशिकाओं के कुशल उन्मूलन के कारण ट्रांसफैक्शन के 10 से 14 दिनों के भीतर प्राप्त किया जा सकता है। आमतौर पर, C2C12 कोशिकाओं के ८०% से अधिक इस समय अवधि के दौरान सेल संस्कृति पकवान से अलग और नियमित सेल रखरखाव के दौरान हटा रहे हैं ।
Puromycin प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं को नियंत्रण या ADAMTSL2 shRNA व्यक्त एक कम सेल घनत्व पर अपने धुरी के आकार, लम्बी सेल आकृति विज्ञान बनाए रखने, साथ ही साथ उनके मायोट्यूब में अंतर करने की क्षमता । सीरम वापसी पर C2C12 भेदभाव उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी और मायोट्यूब मार्कर मायोसिन भारी श्रृंखला के लिए इम्यूनोस्टेपिंग द्वारा निगरानी की जा सकती है । मायोसिन भारी श्रृंखला-सकारात्मक मायोट्यूब भेदभाव दीक्षा के बाद तीन से पांच दिनों के बीच मनाया जाता है और बहुनीय होते हैं, जैसा कि कोशिका सीमाओं के भीतर एक से अधिक DAPI-सकारात्मक नाभिक की उपस्थिति द्वारा मनाया जाता है।
जैसा कि प्रसार स्थितियों में जीन अभिव्यक्ति डेटा प्रदर्शित करता है, ट्रांसफैक्शन की नॉकडाउन दक्षता 40 से 60% पश्चिमी दाग विश्लेषण किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, C2C12 कोशिकाओं से जो कि नियंत्रण श आरएनए व्यक्त कोशिकाओं की तुलना में ADAMTSL2 को लक्षित करता है, कोशिकाओं में नॉकआउट की सफलता की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। चयन प्रक्रिया के दौरान प्यूरोमाइसिन एकाग्रता को बनाए रखना सुनिश्चित करें ताकि सभी गैर-संक्रमित C2C12 कोशिकाओं को खत्म किया जा सके, या गैर-संक्रमित कोशिकाएं संक्रमित कोशिकाओं को आगे बढ़ा सकती हैं। यह परख हमें बाहू रूप से मैट्रिक्स प्रोटीन के कार्य को निर्धारित करने की अनुमति देती है जो बाद में मांसपेशियों के विकास में व्यक्त किए जाते हैं, भले ही उन्हें C2C12 भेदभाव के पांच या 10 दिन बाद प्रेरित किया जाता है।
याद रखें कि आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट और बीटा-मर्केप्टोथेन को धूम हुड में संभाला जाना चाहिए और उचित सुरक्षा प्रोटोकॉल के अनुसार ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड को संभालना चाहिए। देखने के लिए धन्यवाद, और अपने प्रयोग के साथ अच्छी किस्मत।
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
