Login processing...

JoVE Journal
Genetics

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Genetics

Stabil knockdown av gener koding ekstracellulære matrise proteiner i C2C12 Myoblast Cellelinje ved hjelp av små hårnål (sh) RNA

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

Journal (Genetics)

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Journal (Genetics)

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Click here for the English version

Stabil knockdown av gener koding ekstracellulære matrise proteiner i C2C12 Myoblast Cellelinje ved hjelp av små hårnål (sh) RNA

Article DOI: 10.3791/60824-v

February 12th, 2020 •

Nandaraj Taye¹, Sarah Stanley¹, Dirk Hubmacher¹

¹Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

February 12th, 2020

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi gir en protokoll for å stikke ned gener som koder ekstracellulære matriseproteiner (ECM) i C2C12 myoblaster ved hjelp av små hårnål (sh) RNA. Rettet mot ADAMTSL2 som et eksempel, beskriver vi metodene for validering av knockdown-effektiviteten på mRNA-, protein- og cellenivå under C2C12 myoblast til myotubedifferensiering.

Transcript

Denne protokollen er betydelig fordi den tillater oss å studere funksjonen til proteiner, for eksempel ekstracellulære matriseproteiner, som er oppregulert i senere stadier av myotubedannelse eller modning. Denne metoden kan brukes til å slå ned ethvert gen av interesse i C2C12-celler ved hjelp av spesifikke shRNAer og de respektive analytiske verktøyene for fenotyping. Den største fordelen med denne metoden er at vi har generert C2C12-celler som kontinuerlig kan undertrykke våre gener av interesse, selv i modne myotubes.

Det viktigste aspektet ved denne prosedyren er å opprettholde C2C12-celler i udifferensiert tilstand, noe som betyr lav celletetthet under rutinemessig cellekultur. Dagen før transfection, frø fem ganger 10 til fjerde C2C12 celler per milliliter i to milliliter av komplett DMEM per brønn i en seks-brønns plate for å oppnå en 40 til 50% samløpet etter natten inkubasjon ved 37 grader Celsius og 5% CO2. Neste morgen kombinerer du 100 mikroliter med 25-millimolar natriumklorid i ett 1,5-milliliter reaksjonsrør per kultur godt med 25,5 mikroliter PEI lagerløsning av en udifferensiert C2C12 cellekultur for en fem minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius.

Deretter kombinerer du tre mikrogram plasmid-DNA med 100 mikroliter 25-millimolar natriumklorid per kultur godt i en fem minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonene kombinerer du hele volumet av hver fortynnede PEI-reagens med hver fortynnet plasmidløsning med mild pipettering i en 25-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius. Under inkubasjonen erstatter du supernativane i C2C12-cellekulturene med DMEM uten antibiotika eller serum.

På slutten av inkubasjonen legger du til hele volumet av hver transfeksjonsblanding til hver brønn i dråper, mens du kontinuerlig flytter cellekulturfatet. Etter seks timer i cellekulturinkubatoren, erstatt mediet i hver brønn med fullstendig DMEM. 24 timer etter transfection, erstatte hele DMEM i hver brønn med utvalg medium supplert med fem mikrogram per milliliter puromycin, og returnere cellene til cellekulturinkubatoren i 10 til 14 dager eller til stabile C2C12 celler observeres.

Utvid deretter de puromycinresistente C2C12-cellene i lav celletetthetskulturer i nærvær av fem mikrogram per milliliter puromycin, og kryopreserve seks til 10 hetteglass med celler for fremtidig bruk. For å forberede C2C12-cellene for differensiering, frø 1,5 ganger 10 til den femte stabile puromycinresistente C2C12-cellene i en milliliter utvalgsmedium per brønn i en 12-brønnsplate, og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid til kulturene er 95% samløpet. For å indusere differensiering, erstatt mediet i hver brønn med serumfri DMEM annenhver dag etter myotubeformasjonen på et omvendt, lystfeltmikroskop utstyrt med et kamera.

For myosin tung kjede immunostaining av de differensierte cellene, frø fem ganger 10 til fjerde puromycin-resistente C2C12 celler i 500 mikroliter av komplett DMEM per kammer på en åtte-brønns kammer lysbilde, og returnere cellene til cellekultur inkubator. Når cellene når 95% samløpet, erstatt utvalgsmediet i hver brønn med 500 mikroliter serumfri DMEM. Ved passende eksperimentelle tidspunkter, skyll differensieringscellene i hver brønn tre ganger med 5 milliliter PBS per vask før du fester cellene med 200 mikroliter på 4% paraformaldehyd i PBS per brønn.

Etter 15 minutter vask cellene tre ganger med fersk PBS per vask som nettopp demonstrert etterfulgt av inkubasjon med 200 mikroliter 5-molar glycin i PBS per brønn i fem minutter. På slutten av inkubasjonen, vask cellene tre ganger før de gjennomsyrer cellene med 200 mikroliter på 1% ikke-ionisk overflateaktivt middel i PBS i 10 minutter. Deretter blokkerer du de uspesifikke antistoffbindingsstedene med 200 mikroliter på 5 % storfeserumalbumin i PBS per brønn i en time etterfulgt av tre vasker i PBS.

Etter siste vask, merk cellene med 200 mikroliter myosin tungt kjedeantistoff i to timer ved romtemperatur. Etter tre PBS vasker, inkubere cellene med riktig sekundært antistoff i to timer ved romtemperatur, beskyttet mot lys. Etter tre siste vasker, aspirer PBS, og monter cellene med en dråpe monteringsmedium supplert med DAPI og en dekkslips.

Deretter observerer du hvert kammer på et fluorescensmikroskop ved hjelp av riktig filtersett. For å vurdere knockdown effektiviteten i cellekulturer ved vestlig blotting, første frø tre ganger 10 til den femte puromycin-resistente C2C12 celler i to milliliter av komplett DMEM per brønn i en seks-brønns plate. Etter 24 timer, skyll kulturene med PBS, og initier differensiering av cellene med to milliliter serumfri DMEM som demonstrert.

For analyse av de utskillede proteinene på de riktige eksperimentelle tidspunktene, samle en milliliter serumfri betinget medium fra hver godt inn i individuelle 1,5-milliliter reaksjonsrør for sentrifugering. Etter sentrifugering, overføre en milliliter av de bedede mellomstore supernativa til nye 1,5-milliliter reaksjonsrør, og utløse proteiner med 391 mikroliter trikloroacetic syre i ikke-ioniske overflateaktivt middel per rør. Etter 30 sekunder med vortexing, inkuber blandingene på is i 10 minutter.

På slutten av inkubasjonen pellet de utfellingsproteinene ved sentrifugering, og vask proteinpellets tre ganger med frisk iskaldt aceton og en sentrifugasjon per vask. Etter siste vask tørker du pellets i tre til fire minutter ved romtemperatur før du bruker 50 mikroliter SDS-PAGE prøvebuffer per rør. Kok deretter prøvene i fem minutter ved 95 grader Celsius før vestlig flekkanalyse i henhold til standardprotokoller.

For intracellulær og membranbundet proteinanalyse, skyll cellelaget i hver brønn med to milliliter PBS per brønn, og bruk en celleskraper til å forsiktig løsne cellene i ett milliliter volum pbs. Overfør cellene til individuelle 1,5-milliliter rør for sentrifugering etterfulgt av tre vasker i en milliliter PBS per rør per vask via sentrifugering. Etter siste vask, resuspend celle pellets i 200 mikroliter lysis buffer supplert med EDTA-fri protease inhibitor cocktail reagens for en 30-minutters inkubasjon på is.

På slutten av inkubasjonen, ultrasonicate prøvene i 15 sekunder på is med en utgangsinnstilling på 10 med en driftsfrekvens på 23 kilohertz, og fjern celleavfall ved sentrifugering. Overfør supernativane til nye 1,5-milliliter reaksjonsrør, og bestem proteinkonsentrasjonene i henhold til standardprotokoller. Kombiner 100 mikrogram protein med 5X SDS-PAGE prøvebuffer i et totalt volum på 60 mikroliter per prøve, og kok prøvene i fem minutter ved 95 grader Celsius.

Analyser deretter prøvene ved vestlig blotting for tilstedeværelse av ønsket målprotein. Valget av puromycinresistente C2C12-celler kan oppnås innen 10 til 14 dager etter transfeksjon på grunn av en effektiv eliminering av de ikke-resistente cellene. Vanligvis, mer enn 80% av C2C12 cellene løsne fra celle kultur parabolen i denne tidsperioden og fjernes under rutinemessig celle vedlikehold.

Puromycinresistente C2C12-celler som uttrykker kontrollen eller ADAMTSL2 shRNA beholder sin spindelformede, langstrakte cellemorfologi ved lav celletetthet, samt deres evne til å differensiere til myotubes. C2C12 differensiering ved serumuttak kan overvåkes ved lysfeltmikroskopi og immunstaining for myotubemarkøren myosin tung kjede. Myosin tunge kjedepositive myotuber observeres mellom tre til fem dager etter differensieringsinitiering og er multinucleated, som observert av tilstedeværelsen av mer enn én DAPI-positiv kjerne innenfor cellegrensene.

Som genuttrykksdataene i spredningsforhold viser, er knockdown-effektiviteten til transfeksjonen 40 til 60% vestlig flekkanalyse kan utføres for å bekrefte suksessen til knockdown i cellelylater oppnådd, for eksempel fra C2C12-celler som knivtrykker shRNA som retter seg mot ADAMTSL2 sammenlignet med kontroll shRNA som uttrykker celler. Pass på å opprettholde renomycinkonsentrasjonen under utvelgelsesprosessen høyt nok til å eliminere alle de ikke-trans infiserte C2C12-cellene, eller de ikke-trans infiserte cellene kan vokse de trans infiserte cellene. Denne analysen tillater oss å bestemme funksjonen til ekstracellulære matriseproteiner som uttrykkes senere i muskelutvikling, selv om de induseres fem eller 10 dager etter C2C12 differensiering.

Husk at RNA ekstraksjonsreagens og beta-merkaptoetanol skal håndteres i en røykhette og for å håndtere trikloreddiksyre i henhold til de riktige sikkerhetsprotokollene. Takk for at du ser på, og lykke til med eksperimentet.

X

Simple Hit Counter