Indurre radici pelose di Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Utilizzando questo protocollo, dimostreremo il processo passo dopo passo per indurre per la prima volta radici pelose nel grano saraceno di tartaria. Questa tecnica è facile ed economica per iniziare a genomica e microbiomica per il grano saraceno di tartaria e altre piante. Sebbene questo metodo dettagliato sia impostato per il grano saraceno di tartaria, può essere applicato ad altre piante di dicot con alcune modifiche.

Sebbene questo metodo sia facile da eseguire, ha molti passaggi dettagliati. La dimostrazione visiva può aiutare i ricercatori a ottenere un’induzione della radice pelosa più efficiente. A dimostrare la procedura sarà Guangtao Qian, uno studente di Master del mio laboratorio.

Inizia selezionando semi di grano saraceno di tartare paffuto e integro e immergendo i semi in acqua di 28 gradi Celsius per circa 20 minuti. Quando il rivestimento del seme può essere facilmente rimosso, posizionare da 100 a 200 semi pelati in un matraccio conico sterilizzato da 100 millilitri contenente 75% di etanolo per 30 secondi. Al termine della sterilizzazione, sostituire l’etanolo con il 5% di ipoclorito di sodio.

Dopo 15 minuti, decantare l’ipoclorito di sodio e lavare i semi con acqua deionizzata sterile cinque volte. Quindi asciugare i semi con un pezzo di carta bibulosa sterile. Per ottenere piantine di grano saraceno alla tartaria, aggiungere 10 semi per bottiglia a singole bottiglie di coltura di tessuti vegetali da 300 millilitri contenenti 50 millilitri di mezzo MSSA.

Quindi, germinare i semi in una stanza di coltura a 25, più o meno 1, gradi Celsius in condizioni di luce. Dopo 7-10 giorni, seleziona piantine robuste con due pezzi di cotyledon spiegati e taglia le piantine dalle radici. Posizionare le piantine in una piastra di petri sterile e tagliare gli ipoccotili in segmenti da 0,8 a 1 centimetro.

Inchioda i cotyledon in pezzi di circa 0,5 centimetri e pre-coltura gli espianto risultanti in condizioni di luce per 24 ore. Il giorno dopo, trasferire le espianto in un pallone conico sterilizzato da 100 millilitri. Per attivare gli A.rhizogenes, scongelare la coltura sul ghiaccio prima di placcare uniformemente i batteri su un mezzo solido YEB con antibiotici per un’incubazione da 12 a 16 ore a 28 gradi Celsius.

La mattina dopo, scegli una colonia monoclonale per la cultura in una nuova piastra di Petri come appena dimostrato. Dopo un’altra incubazione da 12 a 16 ore, inoculare le colonie monoclonali risultanti in un pallone conico sterilizzato da 100 millilitri contenente 20 millilitri di mezzo solido YEB con antibiotici a 28 gradi Celsius e 200 giri al minuto per 16-18 ore fino a quando la densità ottica a 600 raggiunge 2,0. Quindi trasferire il 2-4% della coltura cellulare batterica in un nuovo pallone conico da 100 millilitri contenente 20 millilitri di mezzo solido YEB fresco con antibiotici a 28 gradi Celsius e 200 giri al minuto per 4-5 ore fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge circa 0,5.

Per indurre la trasformazione della radice pelosa, trasferire la coltura di A.rhizogenes in un tubo conico sterile da 50 millilitri e raccogliere i batteri mediante centrifugazione. Rimescolare il pellet in mezzo MSSAS a una densità ottica di circa 0,2 e infondere la sospensione nel pallone delle espianto. Dopo 10 minuti, rimuovere le espianto dal pallone e tamponarle con un pezzo di carta bibulosa sterile.

Quindi posizionare un pezzo sterile di carta da filtro di 9 centimetri di diametro su un piatto di mezzo MSSAAS e sovrapporre le espianto sulla carta filtrante per un’incubazione di tre giorni a 25 gradi Celsius al buio. Alla fine dell’incubazione, trasferire circa 20 espianto infetti su mssack medio e incubare verticalmente le piante in condizioni di luce a 25, più o meno 1, gradi Celsius. Dopo 10-14 giorni di cultura, seleziona le radici pelose dimostrando un aspetto bianco e una rapida crescita e taglia le radici in pezzi da due a tre centimetri.

Numera chiaramente le radici su una panchina pulita. Sottocultura i pezzi di radice in un pallone conico sterilizzato da 100 millilitri contenente mezzo MSSK a 25 gradi Celsius e 80 giri al minuto al buio fino a quando non si dispendono troppo sul fondo del pallone. Per identificare le radici pelose, rimuovere eventuali radici pelose e contaminate e selezionare quelle con un aspetto bianco.

Se è stato utilizzato un gene reporter, controllare le radici per la fluorescenza sotto un transilluminatore blu o chiaro doppio ultravioletto e selezionare le radici pelose che mostrano un forte segnale fluorescente. Quindi asciugare le radici con carta assorbente e avvolgerle in un foglio di alluminio marcato per un’analisi immediata. Per la conservazione a lungo termine, lyophilize le radici in azoto liquido e posizionare le radici a meno 80 gradi Celsius fino alla loro indagine.

Dopo la trasformazione genetica e la cultura, come dimostrato, le radici pelose mostreranno un colore bianco soffice e un modo plagiotropico nei siti di ferita delle espianto e formeranno una matrice altamente ramificata e interconnessa. Un gene reporter può essere usato per facilitare la differenziazione delle radici pelose transgeniche sotto una transilluminazione ultravioletta doppia blu o chiara, o l’identificazione di un gene bersaglio di interesse. Qui, viene mostrata l’espressione relativa di un fattore di trascrizione indotto dalla luce nelle linee transgeniche delle radici pelose di grano saraceno di tartaria.

In particolare, la biosintesi della rutina e della quercetina sono promosse anche a livello metabolico in risposta alla sovraespressione del fattore di trascrizione indotto. Inoltre, l’espressione genica relativa dei geni della via di sintesi flavenoide in tutte e tre le linee transgeniche, è notevolmente superiore a quelle misurate nel gruppo di controllo, indicando una trasformazione positiva delle radici pelose negli espianto di grano saraceno di tartaria. Cioè l’infezione dei semi, la selezione delle espianto e la concentrazione dei batteri influenzano direttamente il successo dell’induzione della radice pelosa.

Possiamo valutare l’espressione genica, le reazioni proteiche del DNA o delle proteine o la produzione di massa di metaboliti secondari per studiare i metaboliti secondari di regolazione trascrizionale. I batteri ingegnerizzati sono pericolosi per l’uomo e il suo ambiente. Fare attenzione a maneggiare, utilizzare e smaltire correttamente i batteri.