Inducera Hairy Roots av Agrobacterium rhizogenes-medierad transformation i tartary bovete (Fagopyrum tataricum)

Med hjälp av detta protokoll, kommer vi att visa steg för steg process för att inducera håriga rötter i tartary bovete för första gången. Denna teknik är en enkel och billig för att börja genomik och mikrobiomik för tartary bovete och andra växter. Även om denna detaljerade metod är inställd för tartary bovete, kan den tillämpas på andra dicot växter med vissa ändringar.

Även om den här metoden är lätt att utföra, har den många detaljerade steg. Visuell demonstration kan hjälpa forskare att uppnå en effektivare hårig rot induktion. Demonstrerar proceduren blir Guangtao Qian, en Mastersstudent från mitt labb.

Börja med att välja fyllig och oskadad tartary bovete frön och blötläggning fröna i 28 grader Celsius vatten i cirka 20 minuter. När frölacken lätt kan tas bort, placera 100 till 200 skalade frön i en steriliserad 100 milliliter konisk kolv som innehåller 75%etanol i 30 sekunder. Vid slutet av steriliseringen, byt ut etanolen med 5%natriumhypoklorit.

Efter 15 minuter, dekantera natriumhypoklorit och tvätta fröna med sterilt avjoniserat vatten fem gånger. Sedan blot fröna torka med en bit sterilt bibulous papper. För att få tartary bovete plantor, tillsätt 10 frön per flaska till enskilda 300 milliliter växt vävnadskultur flaskor som innehåller 50 milliliter MSSA medium.

Sedan gror fröna i ett kulturrum vid 25, plus eller minus 1, grader Celsius under lätta förhållanden. Efter 7 till 10 dagar, välj robusta plantor med två bitar av ovikta cotyledons och skär plantorna från rötterna. Placera plantorna i en steril petriskål och skär hypokotylerna i 0,8 till 1 centimeter segment.

Sheer cotyledonsna in i ungefärligt 0.5 cm lappar och pre-odlar de resulterande explantsna under ljust villkorar för 24 timmar. Nästa dag, överför explants till en steriliserad 100 milliliter konisk kolv. För att aktivera A.rhizogenes, tina kulturen på is innan jämnt plätering bakterierna på YEB fast medium med antibiotika för en 12 till 16 timmars inkubation vid 28 grader Celsius.

Nästa morgon, välj en monoklonal koloni för kultur i en ny petriskål som just visat. Efter ytterligare 12 till 16 timmars inkubation, inokulera de resulterande monoklonala kolonierna i en steriliserad 100 milliliter konisk kolv som innehåller 20 milliliter YEB fast medium med antibiotika vid 28 grader Celsius och 200 varv per minut i 16 till 18 timmar tills den optiska densiteten vid 600 når 2,0. Överför sedan 2-4%av bakteriecellkulturen till en ny 100 milliliter konisk kolv som innehåller 20 milliliter färskt YEB fast medium med antibiotika vid 28 grader Celsius och 200 varv per minut i 4 till 5 timmar tills den optiska densiteten vid 600 nanometer når cirka 0,5.

För att inducera hårig rot omvandling, överföra A.rhizogenes kultur till en steril 50 milliliter koniska röret och samla bakterierna genom centrifugation. Resuspend pelleten i MSSAS medium till en optisk densitet av ungefär 0,2 och ingjuta suspensionen i kolven av explants. Efter 10 minuter, ta bort explants från kolven och blot dem med en bit sterilt bibulous papper.

Placera sedan en steril 9 centimeter diameter bit av filterpapper på en maträtt av MSSAAS medium och överlagra explants på filterpapper för en tre dagars inkubation på 25 grader Celsius i mörkret. Vid inkubationens överför man cirka 20 infekterade explants till MSSACK-medium och ruvar vertikalt plantorna under lätta förhållanden vid 25, plus eller minus 1, grader Celsius. Efter 10 till 14 dagars kultur väljer du de håriga rötterna som demonstrerar ett vitt utseende och snabb tillväxt och skär rötterna i två till tre centimeter bitar.

Tydligt numrera rötterna på en ren bänk. Subkultur rotbitarna i en steriliserad 100 milliliter konisk kolv som innehåller MSSK-medium vid 25 grader Celsius och 80 varv per minut i mörker tills de överdeplade till botten av kolven. För att identifiera de håriga rötterna, ta bort alla tawny och förorenade håriga rötter och välj de med ett vitt utseende.

Om en reporter gen användes, kontrollera rötterna för fluorescens under en blå eller ljus dubbla ultravioletta transilluminator och välj håriga rötter som uppvisar en stark fluorescerande signal. Torka sedan rötterna med absorberande papper och linda dem i markerad aluminiumfolie för omedelbar analys. För långtidslagring, lyophilize rötterna i flytande kväve och placera rötterna på minus 80 grader Celsius tills deras undersökning.

Efter genetisk omvandling och kultur, som visats, kommer de håriga rötterna uppvisar en fluffig vit färg och ett plagiotropiskt sätt på de explants sårplatser och bildar en mycket förgrenad och interlocked matris. En reporter gen kan användas för att underlätta differentiering av de transgena håriga rötter under en blå eller ljus dubbla ultraviolett transillumination, eller identifiering av ett mål gen av intresse. Här visas det relativa uttrycket av en ljusinducerad transkriptionsfaktor i de transgena linjerna av tartary bovete håriga rötter.

Noterbart är att biosyntesen av rutin och quercetin också främjas på metabolisk nivå som svar på den inducerade transkriptionsfaktorn överuttryck. Vidare är den relativa genen uttryck för flavenoid syntes utbildningsavsnitt gener i alla tre transgena linjer, anmärkningsvärt högre än de som mäts i kontrollgruppen, vilket tyder på en framgångsrik hårig rot omvandling i tartary bovete explants. Det är infektion av fröna, urval av explants, och koncentrationen av bakterierna direkt påverka framgången för den håriga roten induktion.

Vi kan bedöma genuttryck, DNA-protein, eller protein protein reaktioner eller massproduktion av sekundära metaboliter att studera transkriptionell reglering sekundära metaboliter. De konstruerade bakterierna är farliga för människor och hans omgivning. Var noga med att hantera, driva och kassera bakterierna på rätt sätt.