Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Exon Springer i direkte omprogrammeret Myotubes fremstillet af humane urin-afledte celler
Chapters
Summary May 7th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
I denne artikel beskriver vi en detaljeret protokol for effektiv modellering af Duchenne muskelsvind muskel ved hjælp af MYOD1-konverteredeurin-afledte celler til at evaluere restaureringen af dystrophin mRNA og protein niveauer efter exon springe.
Transcript
Vi har etableret en ny protokol for direkte omprogrammering af humane urin-afledte celler i myotubes. Denne in vitro modellering giver os mulighed for at evaluere exon springe i myotubes stammer fra patient med Duchenne muskelsvind. Vi opdagede, at 3-deazaneplanocin En hydrochlorid, DZnep, er histon methyltransferase hæmmer kunne i væsentlig grad fremme direkte screening af UDCs i myotube i en kort tid.
Denne nye autologe UDC baseret sygdom modellering kan føre til ansøgningen præcision medicin for forskellige muskelsygdomme. Til at begynde, centrifuge hele urinprøven ved 400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Dernæst aspirere supernatanten og efterlader en milliliter i røret.
Opslæm pellets individuelt i de resterende en milliliter urin. Saml dem i et enkelt 50 milliliter rør og tilsæt 10 milliliter vask buffer til røret. Centrifuge prøverne ved 200 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
Inspirer supernatanten og efterlader 0,2 milliliter i røret. Opsplitninger af cellepiller i 4,5 milliliter primærmedium. Frø cellerne i tre brønde af gelatine-belagt seks-brønd plade, 1,5 milliliter celle suspension per brønd.
Kultur på 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. I tre dage tilsættes 1,5 milliliter af det primære medium hver dag. På dag fire skal mediet udskiftes med 1,5 milliliter vækstmedium suppleret som beskrevet i manuskriptet.
Efter dag fire, erstatte den supplerede vækstmedium hver anden dag, indtil UDC kultur er 80 til 90% sammenløb. Fjern derefter mediet og vask cellerne med PBS. Opdel cellerne ved hjælp af 0,25%trypsin-EDTA.
Frø cellerne på en massevis på 3, 000 til 5, 000 celler pr kvadreret centimeter på en ny gelatine-belagt 60 millimeter fad. Frø UDCs på 3, 000 til 5, 000 celler per kvadratcentimeter på en gelatine-belagt 60 millimeter fad og læg skålen i inkubatoren. 24 timer efter såning, inficere cellerne med optøet retrovirus ved en mangfoldighed af infektion på 200.
Brug frisk medium med en hexadimethrine bromid koncentration på 8 mikrogram pr. milliliter. Inkubere i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. For at vælge MYOD1-transduced celler, erstatte kultur medium med frisk vækst medium, der indeholder et mikrogram pr. milliliter puromycin.
Fortsæt med at ændre mediet hver anden dag i syv til 10 dage. Plade MYOD1-transduced UDCs i en kollagen belagt multi-godt plade. Efter inkubation af cellerne i 24 timer skal vækstmediet ændres til differentieringsmedium, der er beskrevet i manuskriptet.
Derefter efter tre dage, ændre differentiering medium til frisk differentiering medium uden DZNep. Fortsæt med at ændre mediet hver tredje dag. At transfect antisense oligonukleotid i MYOD1-transduced UDCs, bland ASO transfektion reagens og differentiering medium til en endelig koncentration af en til 10 mikromolar.
Og brug denne blanding til at erstatte mediet i brøndene. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius og 5% fugtighed. Efter 72 timers inkubation med ASO skal medium til frisk differentieringsmedium skiftes uden ASO.
Tre til syv dage efter ASO transfektion, fjerne differentiering medium. Vask UDCs én gang med PBS og tilsæt celle lysis buffer. Høst det samlede RNA ved hjælp af et RNA-ekstraktionssæt.
Mål RNA-koncentrationen med et spektrofotometer. Som beskrevet i manuskriptet skal reagenserne kombineres med et-trins RT-PCR i PCR-rør. Placer PCR-rørene i termocyren, og kør termocyren.
Udfør mikrochip elektroforese og beregne exon springe effektivitet. UDCs blev indsamlet let og noninvasively og dannede kolonier inden for en uge af primær kultur. MYOD1 transfekterede UDCs i differentiering medium med DZNep kunne smelte til hinanden og dannede flernukleerede myorør effektivt.
RT-PCR klart opdaget exon springe i MYOD1-UDCs stammer fra patienter med Duchenne muskelsvind. Springe effektivitet var afhængig af dosis af ASO. Dosisafhængig exon skipping blev også opdaget af Western blot.
Intensiteter af dystrophin blev målt med fluorescerende mikroskop en uge efter ASO transfektion. Markant højere fluorescerende signaler blev observeret i MYOD1-UDCs behandlet med ASO end i kontrol. Vi kan modellere enhver muskelsygdom, der fører til forståelse af patofysiologi af disse sygdomme.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
