Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Exon Пропуск в непосредственно перепрограммированных Myotubes Полученные из человеческих мочи производные клетки
Chapters
Summary May 7th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышечной дистрофии мышц Дюшенна с использованием MYOD1-преобразованныхмочевых клеток для оценки восстановления дистрофин мРНК и уровня белка после пропуска экзона.
Transcript
Мы установили новый протокол для прямого перепрограммирования клеток человека, полученных из мочи, в миотрубы. Это моделирование in vitro позволяет нам оценить exon пропуская в myotubes выведенных от пациента с мышечной дистрофией Duchenne. Мы обнаружили, что 3-deazaneplanocin гидрохлорид, D'nep, являются ингибитором метилтрансферазы гистона может значительно способствовать прямому скринингу UDCs в миоту в короткий промежуток времени.
Это новое аутологичное моделирование болезней на основе УДК может привести к применению точной медицины для различных мышечных заболеваний. Для начала центрифуга всей мочи составляет 400 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее, аспирировать супернатант оставив один миллилитр в трубке.
Resuspend гранулы индивидуально в оставшемся один миллилитр мочи. Соберите их в одну 50 миллилитровую трубку и добавьте 10 миллилитров стирального буфера в трубку. Центрифуга образцов при температуре 200 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Аспирировать супернатант оставляя 0,2 миллилитров в трубке. Повторное производство клеточных гранул в 4,5 миллилитров первичной среды. Семя клетки в трех колодцах желатина покрытием шесть скважин пластины, 1,5 миллилитров клеточной суспензии на скважину.
Культура при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. В течение трех дней добавляйте 1,5 миллилитров первичной среды каждый день. На четвертый день замените носитель 1,5 миллилитров среды роста, дополненных, как описано в рукописи.
После дня четыре, заменить дополненную среду роста через день, пока культура УДК от 80 до 90% стечения. Затем удалите среду и промыть клетки с PBS. Разделите ячейки, используя 0.25%трипсин-EDTA.
Семя клеток при плотности от 3000 до 5000 клеток на квадратный сантиметр на новый желатин покрытием 60 миллиметров блюдо. Семя UDCs на 3000 до 5000 клеток на квадратный сантиметр на желатин покрытием 60 миллиметров блюдо и поместите блюдо в инкубатор. Через 24 часа после посева, заразить клетки с разморожевания ретровируса на множественность инфекции 200.
Используйте свежую среду с концентрацией бромистого гексадиметрина 8 микрограмм на миллилитр. Инкубировать в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. Чтобы выбрать клетки, индуцированные MYOD1, замените культурную среду свежей средой роста, содержащей один микрограмм на миллилитр пуромицина.
Продолжайте менять носитель через день в течение семи-10 дней. Плита MYOD1-трансдуцированных UDCs в коллагена покрытием несколько хорошо пластины. После инкубации клеток в течение 24 часов измените средний рост на среду дифференциации, описанную в рукописи.
Затем, через три дня, измените среду дифференциации на свежую дифференциацию среды без ДЗНЕП. Продолжайте менять носитель каждые три дня. Чтобы трансфицируют антисенсовый олигонуклеотид в MYOD1-трансдуцированные UDCs, смешайте реагент аСО трансинфекции и дифференциацию среды до конечной концентрации от одного до 10 микромолеров.
И использовать эту смесь для замены среды в скважинах. Инкубировать пластину при 37 градусах По Цельсию и 5%влажности. После 72 часов инкубации с ASO, изменить средний на свежий дифференциации среды без ASO.
Через три-семь дней после трансфекции ASO удалите дифференциацию среды. Вымойте UDCs один раз с PBS и добавить буфер лиза ячейки. Урожай общей РНК с помощью комплекта извлечения РНК.
Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра. Как описано в рукописи, объединить реагенты для одношагового RT-PCR в ПЦР труб. Поместите трубки ПЦР в термоциклер и запустите термоциклер.
Выполните электрофорез микрочипа и вычислите эффективность пропуска экзона. UDCs были собраны легко и неинвазивно и сформированные колонии в пределах недели главным образом культуры. MYOD1 трансфицированных UDCs в дифференциации среды с D'Nep может сливаться друг с другом и формируется многоядерных миотрубов эффективно.
RT-PCR четко обнаружены эксон пропуск в MYOD1-UDCs, полученных от пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна. Эффективность пропуска зависит от дозы АСО. Доза-зависимых экзон пропуск был также обнаружен западной пятно.
Интенсивности дистрофина были измерены с помощью флуоресцентного микроскопа через неделю после трансфекции ASO. Заметно более высокие флуоресцентные сигналы наблюдались в MYOD1-UDCs, обработанных ASO, чем в контроле. Мы можем смоделировать любое мышечное заболевание, ведущее к пониманию патофизиологии этих заболеваний.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
